Mismunagreining á lungnahnútum sem greindir eru með tölvusneiðmynd (CT) er enn áskorun í klínískri starfsemi. Hér lýsum við heildarumbrotsefnum 480 sermissýna, þar á meðal heilbrigðra samanburðarhópa, góðkynja lungnahnúta og lungnakirtilkrabbameins á stigi I. Kirtilkrabbamein sýna einstaka efnaskiptaferla, en góðkynja hnútar og heilbrigðir einstaklingar eru mjög líkir í efnaskiptaferlum. Í rannsóknarhópnum (n = 306) voru 27 umbrotsefni greind til að greina á milli góðkynja og illkynja hnúta. AUC aðgreiningarlíkansins í innri staðfestingarhópnum (n = 104) og ytri staðfestingarhópnum (n = 111) var 0,915 og 0,945, talið í sömu röð. Ferilsgreining leiddi í ljós aukin glýkólýsu umbrotsefni tengd minnkuðu tryptófani í sermi lungnakirtilkrabbameins samanborið við góðkynja hnúta og heilbrigðan samanburðarhóp, og benti til þess að upptaka tryptófans stuðli að glýkólýsu í lungnakrabbameinsfrumum. Rannsókn okkar undirstrikar gildi lífmerkja fyrir umbrotsefni í sermi við mat á hættu á lungnahnútum sem greinast með tölvusneiðmynd.
Snemmbúin greining er mikilvæg til að bæta lifunartíðni krabbameinssjúklinga. Niðurstöður úr bandarísku skimunarrannsókninni fyrir lungnakrabbameini (NLST) og evrópsku NELSON-rannsókninni hafa sýnt að skimun með lágskammta tölvusneiðmyndatöku (LDCT) getur dregið verulega úr dánartíðni af völdum lungnakrabbameins í áhættuhópum1,2,3. Frá því að notkun LDCT til skimunar fyrir lungnakrabbameini varð útbreidd hefur tíðni tilfallandi röntgenmynda af einkennalausum lungnahnútum haldið áfram að aukast4. Lungnahnútar eru skilgreindir sem staðbundin ógegnsæi allt að 3 cm í þvermál5. Við stöndum frammi fyrir erfiðleikum við að meta líkur á illkynja æxli og takast á við þann mikla fjölda lungnahnúta sem greinast fyrir tilviljun í LDCT. Takmarkanir tölvusneiðmyndatöku geta leitt til tíðra eftirfylgniskoðana og falskra jákvæðra niðurstaðna, sem leiðir til óþarfa íhlutunar og ofmeðferðar6. Því er þörf á að þróa áreiðanlega og gagnlega lífmerki til að greina lungnakrabbamein rétt á fyrstu stigum og greina á milli flestra góðkynja hnúta við fyrstu greiningu7.
Ítarleg sameindagreining á blóði (sermi, plasma, einkjarnafrumur í útlægum blóði), þar á meðal erfðafræði, próteómfræði eða DNA metýlering8,9,10, hefur leitt til vaxandi áhuga á uppgötvun greiningarmerkja fyrir lungnakrabbamein. Á sama tíma mæla efnaskiptafræðilegar aðferðir lokaafurðir frumna sem eru undir áhrifum innrænna og utanaðkomandi verkunar og eru því notaðar til að spá fyrir um upphaf og afleiðingar sjúkdóms. Vökvaskiljun-tandem massagreining (LC-MS) er mikið notuð aðferð fyrir efnaskiptafræðilegar rannsóknir vegna mikillar næmni og stórs kraftmikils sviðs, sem getur náð yfir umbrotsefni með mismunandi eðlis- og efnafræðilega eiginleika11,12,13. Þó að alþjóðleg efnaskiptagreining á plasma/sermi hafi verið notuð til að bera kennsl á lífmerki sem tengjast greiningu lungnakrabbameins14,15,16,17 og virkni meðferðar,18 þá eru flokkarar sermisefna til að greina á milli góðkynja og illkynja lungnahnúta enn mikið rannsakaðir. - umfangsmiklar rannsóknir.
Kirtilkrabbamein og flöguþekjukrabbamein eru tvær helstu undirgerðir lungnakrabbameins sem ekki er af smáfrumugerð (NSCLC). Ýmsar tölvusneiðmyndaskimunarprófanir benda til þess að kirtilkrabbamein sé algengasta vefjafræðilega gerð lungnakrabbameins1,19,20,21. Í þessari rannsókn notuðum við öfgafullri vökvaskiljun með mikilli upplausn massagreiningar (UPLC-HRMS) til að framkvæma efnaskiptagreiningu á samtals 695 sermissýnum, þar á meðal heilbrigðum samanburðarhópi, góðkynja lungnahnútum og tölvusneiðmyndagreindum ≤3 cm. Skimun fyrir lungnakirtilkrabbameini á stigi I. Við greindum hóp umbrotsefna í sermi sem aðgreina lungnakirtilkrabbamein frá góðkynja hnútum og heilbrigðum samanburðarhópi. Ferilsaukningargreining leiddi í ljós að óeðlileg tryptófan- og glúkósaefnaskipti eru algengar breytingar í lungnakirtilkrabbameini samanborið við góðkynja hnúta og heilbrigðan samanburðarhóp. Að lokum komum við á fót og staðfestum flokkara fyrir efnaskipti í sermi með mikilli sértækni og næmi til að greina á milli illkynja og góðkynja lungnahnúta sem greindir eru með LDCT, sem getur hjálpað við snemmbúna mismunagreiningu og áhættumat.
Í þessari rannsókn voru sermissýni, samsvöruð kyni og aldri, tekin afturskyggnt frá 174 heilbrigðum samanburðarhópi, 292 sjúklingum með góðkynja lungnahnútum og 229 sjúklingum með lungnakirtilkrabbamein á stigi I. Lýðfræðileg einkenni þátttakenda 695 eru sýnd í viðbótartöflu 1.
Eins og sést á mynd 1a voru alls 480 sermissýni, þar á meðal 174 heilbrigð samanburðarhópur (HC), 170 góðkynja hnútar (BN) og 136 sýni af lungnakirtilkrabbameini (LA) á I. stigi, tekin á krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans. Uppgötvunarhópur fyrir ómarkvissa efnaskiptagreiningu með því að nota öfgafullrar vökvaskiljun með mikilli upplausn massagreiningar (UPLC-HRMS). Eins og sést á viðbótarmynd 1 voru mismunandi umbrotsefni milli LA og HC, LA og BN greind til að koma á flokkunarlíkani og kanna frekar greiningu á mismunandi ferlum. 104 sýni sem söfnuð voru af krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans og 111 sýni sem söfnuð voru af tveimur öðrum sjúkrahúsum voru prófuð innri og ytri, talið í sömu röð.
a Rannsóknarhópur í uppgötvunarhópnum sem gekkst undir alþjóðlega sermisefnaskiptagreiningu með öfgafullri afkastavökvaskiljun með mikilli upplausn massagreiningar (UPLC-HRMS). b Hlutlæg minnstu kvaðrata aðgreiningargreining (PLS-DA) á heildarumbrotsefnum 480 sermissýna úr rannsóknarhópnum, þar á meðal heilbrigðum samanburðarhópi (HC, n = 174), góðkynja hnútum (BN, n = 170) og lungnakrabbameini á stigi I (Los Angeles, n = 136). +ESI, jákvæð rafúðajónunarháttur, -ESI, neikvæð rafúðajónunarháttur. c–e Umbrotsefni með marktækt mismunandi magn í tveimur gefnum hópum (tvíhliða Wilcoxon signed rank test, leiðrétt p gildi fyrir falskt uppgötvunarhlutfall, FDR <0,05) eru sýnd í rauðu (feldbreyting > 1,2) og bláu (feldbreyting < 0,83). ) sýnd á eldfjallamyndinni. f Stigveldisbundið hitakort sem sýnir marktækan mun á fjölda skýrðra umbrotsefna milli LA og BN. Upprunagögn eru veitt í formi upprunagagnaskráa.
Heildar sermisumbrotsefni 174 HC, 170 BN og 136 LA í uppgötvunarhópnum voru greind með UPLC-HRMS greiningu. Við sýnum fyrst fram á að gæðaeftirlitssýni (QC) þyrpast þétt saman í miðju óstýrðrar aðalþáttagreiningar (PCA) líkans, sem staðfestir stöðugleika frammistöðu núverandi rannsóknar (viðbótarmynd 2).
Eins og sést í aðgreiningaraðferð með hluta minnstu kvaðrata (PLS-DA) á mynd 1b, komumst við að því að það var greinilegur munur á LA og BN, LA og HC í jákvæðum (+ESI) og neikvæðum (-ESI) rafúðajónunarham. Hins vegar fannst enginn marktækur munur á BN og HC í +ESI og -ESI aðstæðum.
Við fundum 382 mismunandi eiginleika milli LA og HC, 231 mismunandi eiginleika milli LA og BN, og 95 mismunandi eiginleika milli BN og HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 og margfeldi breytingar >1,2 eða <0,83) (Mynd .1c-e). Toppar voru frekar skýrðir (viðbótargögn 3) gegn gagnagrunni (mzCloud/HMDB/Chemspider bókasafn) með m/z gildi, varðveislutíma og leit að sundrunarmassarófi (upplýsingar lýstar í aðferðakaflanum) 22. Að lokum voru 33 og 38 skýrð umbrotsefni með marktækum mun á magni greind fyrir LA á móti BN (Mynd 1f og viðbótartafla 2) og LA á móti HC (viðbótarmynd 3 og viðbótartafla 2), talið í sömu röð. Aftur á móti voru aðeins 3 umbrotsefni með marktækum mun á magni greind í BN og HC (viðbótartafla 2), sem er í samræmi við skörunina milli BN og HC í PLS-DA. Þessi mismunandi umbrotsefni spanna fjölbreytt úrval lífefna (viðbótarmynd 4). Samanlagt sýna þessar niðurstöður marktækar breytingar á umbrotsefnum sermis sem endurspegla illkynja umbreytingu lungnakrabbameins á frumstigi samanborið við góðkynja lungnahnúta hjá heilbrigðum einstaklingum. Á sama tíma bendir líkindi umbrotsefna sermis BN og HC til þess að góðkynja lungnahnútar geti deilt mörgum líffræðilegum eiginleikum með heilbrigðum einstaklingum. Þar sem stökkbreytingar í epidermal growth factor receptor (EGFR) geni eru algengar í lungnakirtilkrabbameini af undirgerð 23, reyndum við að ákvarða áhrif drifkraftsstökkbreytinga á umbrotsefnið í sermi. Við greindum síðan heildarumbrotsmynstur 72 tilfella með EGFR stöðu í lungnakirtilkrabbameinshópnum. Athyglisvert er að við fundum sambærileg snið milli sjúklinga með EGFR stökkbreytingu (n = 41) og sjúklinga með villta gerð EGFR (n = 31) í PCA greiningu (viðbótarmynd 5a). Hins vegar greindum við 7 umbrotsefni þar sem magn þeirra breyttist marktækt hjá sjúklingum með EGFR stökkbreytingu samanborið við sjúklinga með villta gerð EGFR (t-próf, p < 0,05 og margföld breyting > 1,2 eða < 0,83) (Viðbótarmynd 5b). Meirihluti þessara umbrotsefna (5 af 7) eru asýlkarnitín, sem gegna mikilvægu hlutverki í oxunarferlum fitusýra.
Eins og sýnt er í vinnuflæðinu sem sýnt er á mynd 2 a, voru lífmerki fyrir flokkun hnúta fengin með því að nota minnstu algeru rýrnunaraðgerðir og val byggt á 33 mismunandi umbrotsefnum sem greind voru í LA (n = 136) og BN (n = 170). Besta samsetning breyta (LASSO) - tvíundaraðhvarfslíkan. Tíuföld krossprófun var notuð til að prófa áreiðanleika líkansins. Breytuval og breytureglugerð eru leiðrétt með líkindahámörkunarrefsingu með breytunni λ24. Alþjóðleg efnaskiptagreining var síðan framkvæmd sjálfstætt í innri prófunarhópnum (n = 104) og ytri prófunarhópnum (n = 111) til að prófa flokkunarárangur aðgreiningarlíkansins. Fyrir vikið voru 27 umbrotsefni í uppgötvunarmenginu greind sem besta aðgreiningarlíkanið með hæsta meðal AUC gildi (Mynd 2b), þar af höfðu 9 aukna virkni og 18 minnkaða virkni í LA samanborið við BN (Mynd 2c).
Vinnuflæði til að smíða flokkara fyrir lungnahnútar, þar á meðal að velja besta hópinn af sermisumbrotsefnum í uppgötvunarsettinu með því að nota tvíþætta lógistíska aðhvarfsgreiningu í gegnum tífalda krossprófun og meta spárgetu í innri og ytri prófunarsettum. b Krossprófunartölfræði fyrir LASSO aðhvarfsgreiningu fyrir val á efnaskiptalífmerkjum. Tölurnar sem gefnar eru hér að ofan tákna meðalfjölda lífmerkja sem valin eru við tiltekið λ. Rauða punktalínan táknar meðal AUC gildi við samsvarandi lambda. Gráar villustikur tákna lágmarks- og hámarks AUC gildi. Punktalínan gefur til kynna besta líkanið með 27 völdum lífmerkjum. AUC, flatarmál undir ROC ferlinum (receiver operating characteristic). c Breytingar á 27 völdum umbrotsefnum í LA hópnum samanborið við BN hópinn í uppgötvunarhópnum. Rauður dálkur - virkjun. Blái dálkurinn sýnir lækkun. d–f ROC ferlar (receiver operating characteristic) sem sýna afl aðgreiningarlíkansins byggt á 27 umbrotsefnasamsetningum í uppgötvunar-, innri og ytri prófunarsettum. Upprunagögn eru veitt í formi upprunagagnaskráa.
Spálíkan var búið til byggt á vegnum aðhvarfsstuðlum þessara 27 umbrotsefna (viðbótartafla 3). ROC greining byggð á þessum 27 umbrotsefnum gaf flatarmál undir ferlinum (AUC) gildi upp á 0,933, næmi uppgötvunarhópsins var 0,868 og sértækni var 0,859 (mynd 2d). Á sama tíma, meðal 38 skýrðra mismunandi umbrotsefna milli LA og HC, náði safn af 16 umbrotsefnum AUC upp á 0,902 með næmi upp á 0,801 og sértækni upp á 0,856 við að greina á milli LA og HC (viðbótarmynd 6a-c). AUC gildi byggð á mismunandi breytingamörkum fyrir mismunandi umbrotsefni voru einnig borin saman. Við komumst að því að flokkunarlíkanið stóð sig best við að greina á milli LA og BN (HC) þegar breytingastigið var stillt á 1,2 á móti 1,5 eða 2,0 (viðbótarmynd 7a,b). Flokkunarlíkanið, sem byggir á 27 umbrotsefnahópum, var frekar staðfest í innri og ytri hópum. AUC var 0,915 (næmi 0,867, sértækni 0,811) fyrir innri staðfestingu og 0,945 (næmi 0,810, sértækni 0,979) fyrir ytri staðfestingu (Mynd 2e, f). Til að meta skilvirkni milli rannsóknarstofa voru 40 sýni úr ytri hópnum greind í ytri rannsóknarstofu eins og lýst er í aðferðakaflanum. Nákvæmni flokkunarinnar náði AUC upp á 0,925 (Viðbótarmynd 8). Þar sem flöguþekjukrabbamein í lungum (LUSC) er næst algengasta undirtegund lungnakrabbameins sem ekki er af smáfrumugerð (NSCLC) á eftir lungnakirtilkrabbameini (LUAD), prófuðum við einnig staðfesta möguleika notagildi efnaskiptasniðs. BN og 16 tilfelli af LUSC. AUC greinarmunar á milli LUSC og BN var 0,776 (Viðbótarmynd 9), sem bendir til lakari greinarmunar á milli LUAD og BN samanborið við hæfni til að greina á milli LUAD og BN.
Rannsóknir hafa sýnt að stærð hnúta á tölvusneiðmyndum hefur jákvætt samband við líkur á illkynja æxli og er enn mikilvægur áhrifaþáttur í meðferð hnúta25,26,27. Greining á gögnum úr stóra hópnum í NELSON skimunarrannsókninni sýndi að hætta á illkynja æxli hjá einstaklingum með eitla <5 mm var jafnvel svipuð og hjá einstaklingum án eitla28. Þess vegna er lágmarksstærð sem krefst reglulegs eftirlits með tölvusneiðmynd 5 mm, eins og Breska brjóstholsfélagið (BTS) mælir með, og 6 mm, eins og Fleischnerfélagið mælir með29. Hins vegar eru hnútar stærri en 6 mm og án augljósra góðkynja einkenna, kallaðir óákveðnir lungnahnútar (IPN), enn mikil áskorun í mati og meðferð í klínískri starfsemi30,31. Við skoðuðum næst hvort stærð hnúta hefði áhrif á efnaskiptaeinkenni með því að nota sameinuð sýni úr uppgötvunar- og innri staðfestingarhópunum. Með áherslu á 27 staðfesta lífmerki bárum við fyrst saman PCA snið HC og BN sub-6 mm umbrotsefna. Við komumst að því að flestir gagnapunktar fyrir HC og BN sköruðust, sem sýnir að sermisþéttni umbrotsefna var svipuð í báðum hópunum (Mynd 3a). Einkennakortin yfir mismunandi stærðarbil voru varðveitt í BN og LA (Mynd 3b, c), en aðgreining sást á milli illkynja og góðkynja hnúta á bilinu 6–20 mm (Mynd 3d). Þessi hópur hafði AUC upp á 0,927, sértækni upp á 0,868 og næmi upp á 0,820 til að spá fyrir um illkynja æxli hnúta sem mældust 6 til 20 mm (Mynd 3e, f). Niðurstöður okkar sýna að flokkarinn getur fangað efnaskiptabreytingar af völdum snemmbúinnar illkynja umbreytingar, óháð stærð hnúta.
aug. Samanburður á PCA sniðum milli tilgreindra hópa byggður á efnaskiptaflokki 27 umbrotsefna. CC og BN < 6 mm. b BN < 6 mm á móti BN 6–20 mm. í LA 6–20 mm á móti LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm og LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Rekstrareiginleikar móttakara (ROC) ferill sem sýnir frammistöðu aðgreiningarlíkans fyrir hnúta sem mældust 6–20 mm. f Líkindagildi voru reiknuð út frá lógískri aðhvarfsgreiningu fyrir hnúta sem mældust 6–20 mm. Gráa punktalínan táknar besta viðmiðunargildið (0,455). Tölurnar hér að ofan tákna hlutfall tilfella sem spáð er fyrir Los Angeles. Notið tvíhliða Student's t-próf. PCA, aðalþáttagreining. AUC-flatarmál undir ferlinum. Upprunagögn eru gefin upp í formi upprunagagnaskráa.
Fjögur sýni (á aldrinum 44–61 árs) með svipaða stærð lungnahnúta (7–9 mm) voru valin frekar til að sýna fram á virkni fyrirhugaðrar spálíkans fyrir illkynja sjúkdóma (Mynd 4a, b). Við fyrstu skimun kom fram að tilvik 1 var fastur hnútur með kalkmyndun, sem er einkenni sem tengist góðkynja sjúkdómi, en tilvik 2 kom fram sem óákveðinn, að hluta til fastur hnútur án augljósra góðkynja einkenna. Þrjár umferðir af eftirfylgni-tölvusneiðmyndum sýndu að þessi tilfelli voru stöðug yfir fjögurra ára tímabil og voru því talin góðkynja hnútar (Mynd 4a). Í samanburði við klínískt mat á raðbundnum tölvusneiðmyndum, greindi einnota greining á sermisefnaskiptum með núverandi flokkunarlíkani þessa góðkynja hnúta fljótt og rétt út frá líkindafræðilegum takmörkunum (Tafla 1). Mynd 4b í tilviki 3 sýnir hnúta með merkjum um fleiðrusamdrátt, sem oftast er tengdur illkynja sjúkdómi32. Tilvik 4 kom fram sem óákveðinn, að hluta til fastur hnútur án vísbendinga um góðkynja orsök. Öll þessi tilfelli voru spáð sem illkynja samkvæmt flokkunarlíkaninu (Tafla 1). Mat á lungnakirtilkrabbameini var sýnt fram á með vefjameinafræðilegri rannsókn eftir lungnaaðgerð (Mynd 4b). Fyrir ytri staðfestingarsettið spáði efnaskiptaflokkurinn nákvæmlega fyrir um tvö tilfelli af óákveðnum lungnahnútum stærri en 6 mm (Viðbótarmynd 10).
Tölvusneiðmyndir af lungnablaðinu með áslægum glugga í tveimur tilfellum góðkynja hnúta. Í tilviki 1 sýndi tölvusneiðmynd eftir 4 ár stöðugan, fastan hnúta sem mældist 7 mm með kalkmyndun í neðri hægra blaði. Í tilviki 2 leiddi tölvusneiðmynd eftir 5 ár í ljós stöðugan, að hluta til fastan hnúta með 7 mm þvermál í efri hægra blaði. b Tölvusneiðmyndir af lungum með áslægum glugga og samsvarandi meinafræðilegar rannsóknir á tveimur tilfellum af kirtilkrabbameini á stigi I fyrir lungnaaðgerð. Tilvik 3 leiddi í ljós hnúta með 8 mm þvermál í efri hægra blaði með fleiðruendurdrátt. Tilvik 4 leiddi í ljós að hluta til fastan, slípaðan glerhnúta sem mældist 9 mm í efri vinstra blaði. Hematoxýlín og eósín (H&E) litun á skurðuðum lungnavef (kvarðastika = 50 μm) sýnir vaxtarmynstur lungnakirtilkrabbameins í þráðum. Örvar gefa til kynna hnúta sem greinast á tölvusneiðmyndum. H&E myndirnar eru dæmigerðar myndir af mörgum (>3) smásjársvæðum sem meinafræðingurinn skoðaði.
Niðurstöður okkar sýna samanlagt fram á mögulegt gildi lífmerkja fyrir umbrotsefni í sermi við mismunagreiningu lungnahnúta, sem getur verið áskorun við mat á tölvusneiðmyndatöku.
Við reyndum að bera kennsl á líffræðileg tengsl helstu efnaskiptabreytinga með því að nota staðfesta samanburðarhóp fyrir mismunandi efnaskiptaferla. KEGG ferlaauðgunargreining MetaboAnalyst benti á 6 sameiginlegar marktækt breyttar ferlar milli þessara tveggja hópa (LA vs. HC og LA vs. BN, leiðrétt p ≤ 0,001, áhrif > 0,01). Þessar breytingar einkenndust af truflunum á pýrúvatumbrotum, tryptófanumbrotum, níasín- og nikótínamíðumbrotum, glýkólýsu, TCA hringrásinni og púrínumbrotum (Mynd 5a). Við framkvæmdum síðan markvissar efnaskiptafræðilegar rannsóknir til að staðfesta helstu breytingar með því að nota algera magngreiningu. Ákvörðun sameiginlegra efnaskiptaefna í algengum breytingum á ferlum var gerð með þrípóla massagreiningu (QQQ) með því að nota áreiðanleg efnaskiptastaðla. Lýðfræðileg einkenni marksýnisins í efnaskiptarannsókninni eru innifalin í viðbótartöflu 4. Í samræmi við niðurstöður okkar úr heildarefnaskiptarannsóknum staðfesti megindleg greining að hýpóxantín og xantín, pýrúvat og laktat voru aukin í LA samanborið við BN og HC (Mynd 5b, c, p <0,05). Hins vegar fannst enginn marktækur munur á þessum umbrotsefnum milli BN og HC.
KEGG ferilsauðgunargreining á marktækt mismunandi umbrotsefnum í LA hópnum samanborið við BN og HC hópana. Tvíhliða Globaltest var notað og p gildi voru leiðrétt með Holm-Bonferroni aðferðinni (leiðrétt p ≤ 0,001 og áhrifastærð > 0,01). b–d Fiðlumyndrit sem sýna magn hýpóxantíns, xantíns, laktats, pýrúvats og tryptófans í sermis HC, BN og LA ákvarðað með LC-MS/MS (n = 70 í hverjum hópi). Hvítar og svartar punktalínur gefa til kynna miðgildi og fjórðungsgildi, talið í sömu röð. e Fiðlumyndrit sem sýnir staðlaða Log2TPM (umrit á milljón) mRNA tjáningu SLC7A5 og QPRT í lungnakirtilkrabbameini (n = 513) samanborið við eðlilegan lungnavef (n = 59) í LUAD-TCGA gagnasafninu. Hvíti kassinn táknar fjórðungsbilið, lárétta svarta línan í miðjunni táknar miðgildið og lóðrétta svarta línan sem nær frá kassanum táknar 95% öryggisbil (CI). f Pearson fylgnirit af SLC7A5 og GAPDH tjáningu í lungnakirtilkrabbameini (n = 513) og eðlilegum lungnavef (n = 59) í TCGA gagnasafninu. Gráa svæðið táknar 95% öryggisbilið. r, Pearson fylgnistuðull. g Stöðluð frumutryptófanmagn í A549 frumum sem voru erfðabreyttar með ósértækri shRNA samanburðarfrumu (NC) og shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ákvarðað með LC-MS/MS. Tölfræðileg greining á fimm líffræðilega óháðum sýnum í hverjum hópi er kynnt. h Frumumagn NADt (heildar NAD, þar á meðal NAD+ og NADH) í A549 frumum (NC) og SLC7A5 niðurfelldum A549 frumum (Sh1, Sh2). Tölfræðileg greining á þremur líffræðilega óháðum sýnum í hverjum hópi er kynnt. i Glýkólýsuvirkni A549 frumna fyrir og eftir niðurfellingu SLC7A5 var mæld með utanfrumusýrustigi (ECAR) (n = 4 líffræðilega óháð sýni í hverjum hópi). 2-DG,2-deoxý-D-glúkósi. Tvíhliða Student's t-próf var notað í (b–h). Í (g–i) tákna villustikur meðaltal ± staðalfrávik, hver tilraun var framkvæmd þrisvar sinnum óháð og niðurstöðurnar voru svipaðar. Upprunagögn eru gefin í formi upprunagagnaskráa.
Með hliðsjón af verulegum áhrifum breyttra tryptófanefnaskipta í LA hópnum, mátum við einnig tryptófangildi í sermi í HC, BN og LA hópunum með því að nota QQQ. Við komumst að því að tryptófangildi í sermi voru lægri í LA samanborið við HC eða BN (p < 0,001, mynd 5d), sem er í samræmi við fyrri niðurstöður um að tryptófangildi í blóðrás eru lægri hjá sjúklingum með lungnakrabbamein en hjá heilbrigðum samanburðarhópi úr samanburðarhópnum33,34,35. Önnur rannsókn sem notaði PET/CT merkiefnið 11C-metýl-L-tryptófan leiddi í ljós að geymslutími tryptófanmerkis í lungnakrabbameinsvef var marktækt lengri samanborið við góðkynja meinsemdir eða eðlilegan vef36. Við gerum ráð fyrir að minnkun tryptófans í LA sermi gæti endurspeglað virka upptöku tryptófans af lungnakrabbameinsfrumum.
Einnig er vitað að lokaafurð kynúrenín-ferilsins í niðurbroti tryptófans er NAD+37,38, sem er mikilvægt hvarfefni fyrir efnahvörf glýseraldehýð-3-fosfats við 1,3-bisfosfóglýserat í glýkólýsu39. Þó fyrri rannsóknir hafi einbeitt sér að hlutverki niðurbrots tryptófans í ónæmisstjórnun, reyndum við að skýra samspilið milli truflunar á tryptófani og glýkólýsuferla sem komu fram í þessari rannsókn. Flutningsprótein fjölskyldu 7, meðlimur 5 (SLC7A5), er þekkt fyrir að vera tryptófanflutningsprótein43,44,45. Kínólínsýrufosfóríbósýltransferasi (QPRT) er ensím staðsett niðurstreymis kynúrenín-ferilsins sem breytir kínólínsýru í NAMN46. Skoðun á LUAD TCGA gagnasafninu leiddi í ljós að bæði SLC7A5 og QPRT voru marktækt uppstýrð í æxlisvef samanborið við eðlilegan vef (Mynd 5e). Þessi aukning sást í stigum I og II sem og stigum III og IV af lungnakirtilkrabbameini (viðbótarmynd 11), sem bendir til snemmbúinna truflana í efnaskiptum tryptófans tengdum æxlismyndun.
Að auki sýndi LUAD-TCGA gagnasafn jákvæða fylgni milli SLC7A5 og GAPDH mRNA tjáningar í sýnum krabbameinssjúklinga (r = 0,45, p = 1,55E-26, mynd 5f). Hins vegar fannst engin marktæk fylgni milli slíkra genaeinkenna í eðlilegum lungnavef (r = 0,25, p = 0,06, mynd 5f). Niðurbrot SLC7A5 (viðbótarmynd 12) í A549 frumum minnkaði verulega magn tryptófans og NAD(H) í frumuvef (mynd 5g,h), sem leiddi til minnkaðrar glýkólýsuvirkni eins og mælt er með utanfrumusýrustigi (ECAR) (mynd 1). 5i). Þannig, byggt á efnaskiptabreytingum í sermi og in vitro greiningu, gerum við ráð fyrir að efnaskipti tryptófans geti framleitt NAD+ í gegnum kynúrenínferilinn og gegnt mikilvægu hlutverki í að efla glýkólýsu í lungnakrabbameini.
Rannsóknir hafa sýnt að fjöldi óákveðinna lungnahnúta sem greindir eru með LDCT getur leitt til þess að þörf sé á frekari prófum eins og PET-CT, lungnasýnatöku og ofmeðferð vegna falskt jákvæðrar greiningar á illkynja æxli.31 Eins og sést á mynd 6, benti rannsókn okkar á hóp umbrotsefna í sermi með mögulegt greiningargildi sem gætu bætt áhættumat og síðari meðferð lungnahnúta sem greindir eru með tölvusneiðmynd.
Lungnahnútar eru metnir með lágskammta tölvusneiðmyndatöku (LDCT) með myndgreiningareinkennum sem benda til góðkynja eða illkynja orsaka. Óviss útkoma hnúta getur leitt til tíðra eftirfylgniheimsókna, óþarfa íhlutunar og ofmeðferðar. Með því að flokka efnaskipti í sermi með greiningargildi getur það bætt áhættumat og síðari meðferð lungnahnúta. PET positron emission tomography.
Gögn úr bandarísku NLST rannsókninni og evrópsku NELSON rannsókninni benda til þess að skimun áhættuhópa með lágskammta tölvusneiðmyndatöku (LDCT) geti dregið úr dánartíðni af völdum lungnakrabbameins1,3. Hins vegar er áhættumat og síðari klínísk meðferð á fjölda tilfallandi lungnahnúta sem greinast með LDCT enn erfiðust. Meginmarkmiðið er að hámarka rétta flokkun núverandi LDCT-byggðra aðferða með því að fella inn áreiðanlega lífmerki.
Ákveðnir sameindalífmerki, svo sem umbrotsefni í blóði, hafa verið greindir með því að bera saman lungnakrabbamein við heilbrigðan samanburðarhóp15,17. Í þessari rannsókn einbeittum við okkur að notkun efnaskiptagreiningar í sermi til að greina á milli góðkynja og illkynja lungnahnúta sem greindir voru fyrir slysni með LDCT. Við bárum saman heildarumbrotsefni í sermi heilbrigðs samanburðarhóps (HC), góðkynja lungnahnúta (BN) og lungnakirtilkrabbameinssýna af stigi I með því að nota UPLC-HRMS greiningu. Við komumst að því að HC og BN höfðu svipaða efnaskiptaferla, en LA sýndi marktækar breytingar samanborið við HC og BN. Við greindum tvö sett af umbrotsefnum í sermi sem aðgreina LA frá HC og BN.
Núverandi greiningarkerfi fyrir góðkynja og illkynja hnúta, byggt á LDCT, byggist aðallega á stærð, þéttleika, formgerð og vaxtarhraða hnúta með tímanum30. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að stærð hnúta tengist náið líkum á lungnakrabbameini. Jafnvel hjá sjúklingum í mikilli áhættu er hætta á illkynja æxli í eitlum <6 mm <1%. Hætta á illkynja æxli fyrir hnúta sem eru 6 til 20 mm að stærð er á bilinu 8% til 64%30. Þess vegna mælir Fleischner-félagið með viðmiðunarþvermál upp á 6 mm fyrir reglubundna eftirfylgni með tölvusneiðmynd.29 Hins vegar hefur áhættumat og meðferð óákveðinna lungnahnúta (IPN) stærri en 6 mm ekki verið fullnægjandi framkvæmd 31. Núverandi meðferð meðfæddra hjartasjúkdóma byggist venjulega á vökulum biðtíma með tíðu eftirliti með tölvusneiðmynd.
Byggt á staðfestu umbrotsefni sýndum við fram á í fyrsta skipti skörun umbrotseinkenna milli heilbrigðra einstaklinga og góðkynja hnúta <6 mm. Líffræðilegi líkindin eru í samræmi við fyrri niðurstöður úr tölvusneiðmyndatöku um að hætta á illkynja æxli fyrir hnúta <6 mm er jafn lítil og hjá einstaklingum án eitla.30 Það skal tekið fram að niðurstöður okkar sýna einnig að góðkynja hnútar <6 mm og ≥6 mm hafa mikla líkindi í efnaskiptaferlum, sem bendir til þess að virknisskilgreining á góðkynja orsökum sé samræmd óháð stærð hnúta. Þannig geta nútíma greiningarhópar fyrir umbrotsefni í sermi veitt eina greiningu sem útilokunarpróf þegar hnútar greinast upphaflega á tölvusneiðmyndatöku og hugsanlega dregið úr reglubundnu eftirliti. Á sama tíma greindi sami hópur efnaskiptalífmerkja á milli illkynja hnúta ≥6 mm að stærð frá góðkynja hnútum og gaf nákvæmar spár fyrir IPN af svipaðri stærð og óljósum formfræðilegum eiginleikum á tölvusneiðmyndum. Þessi flokkari fyrir umbrot í sermi stóð sig vel í að spá fyrir um illkynja æxli hnúta ≥6 mm með AUC upp á 0,927. Samanlagt benda niðurstöður okkar til þess að einstök efnaskiptaeinkenni sermis gætu sérstaklega endurspeglað snemmbúnar efnaskiptabreytingar af völdum æxla og hafi hugsanlegt gildi sem áhættuspár, óháð stærð hnúta.
Athyglisvert er að lungnakirtilkrabbamein (LUAD) og flöguþekjukrabbamein (LUSC) eru helstu gerðir lungnakrabbameins sem ekki er af smáfrumugerð (NSCLC). Þar sem LUSC tengist sterklega tóbaksnotkun47 og LUAD er algengasta vefjagerð tilfallandi lungnahnúta sem greinast við tölvusneiðmyndatöku48, var flokkunarlíkan okkar sérstaklega hannað fyrir sýni af kirtilkrabbameini á stigi I. Wang og samstarfsmenn einbeittu sér einnig að LUAD og greindu níu fitueinkenni með því að nota fituefnagreiningu til að greina á milli lungnakrabbameins á fyrstu stigum og heilbrigðra einstaklinga17. Við prófuðum núverandi flokkunarlíkan á 16 tilfellum af LUSC á stigi I og 74 góðkynja hnútum og komumst að lágri spánákvæmni fyrir LUSC (AUC 0,776), sem bendir til þess að LUAD og LUSC gætu haft sín eigin efnaskiptaeinkenni. Reyndar hefur verið sýnt fram á að LUAD og LUSC eru ólík hvað varðar orsök, líffræðilegan uppruna og erfðafrávik49. Þess vegna ætti að taka aðrar gerðir vefjagreiningar með í þjálfunarlíkön fyrir þýðisbundna greiningu lungnakrabbameins í skimunarverkefnum.
Hér greindum við sex algengustu breyttu ferla í lungnakirtilkrabbameini samanborið við heilbrigðan samanburðarhóp og góðkynja hnúta. Xantín og hýpóxantín eru algeng umbrotsefni púrína umbrotsferilsins. Í samræmi við niðurstöður okkar voru milliefni sem tengjast púrína umbrotum marktækt aukin í sermi eða vefjum sjúklinga með lungnakirtilkrabbamein samanborið við heilbrigðan samanburðarhóp eða sjúklinga á forinnrásarstigi15,50. Hækkað magn xantíns og hýpóxantíns í sermi gæti endurspeglað þá umbrotsvirkni sem krabbameinsfrumur í ört vaxandi mæli þurfa. Truflun á glúkósaumbrotum er vel þekkt einkenni krabbameinsumbrota51. Hér sáum við marktæka aukningu á pýrúvati og laktati í LA hópnum samanborið við HC og BN hópinn, sem er í samræmi við fyrri skýrslur um frávik í glýkólýsuferlum í umbrotsferlum í sermi sjúklinga með lungnakrabbamein sem ekki er af smáfrumugerð (NSCLC) og heilbrigðan samanburðarhóp. Niðurstöðurnar eru í samræmi52,53.
Mikilvægt er að hafa í huga að við sáum öfuga fylgni milli pýrúvats og efnaskipta tryptófans í sermi lungnakirtilkrabbameins. Tryptófangildi í sermi voru lægri í LA hópnum samanborið við HC eða BN hópinn. Áhugavert er að fyrri stór rannsókn með framskyggnum hópi leiddi í ljós að lágt magn tryptófans í blóðrás tengdist aukinni hættu á lungnakrabbameini 54. Tryptófan er nauðsynleg amínósýra sem við fáum eingöngu úr mat. Við ályktum að lækkun tryptófans í sermi í lungnakirtilkrabbameini gæti endurspeglað hraða lækkun þessa umbrotsefnis. Það er vel þekkt að lokaafurð niðurbrots tryptófans í gegnum kynúrenín ferilinn er uppspretta nýmyndunar NAD+. Þar sem NAD+ er aðallega framleitt í gegnum björgunarferilinn, er mikilvægi NAD+ í efnaskiptum tryptófans í heilsu og sjúkdómum enn óljóst 46. Greining okkar á TCGA gagnagrunninum sýndi að tjáning tryptófanflutningspróteinsins 7A5 (SLC7A5) jókst marktækt í lungnakirtilkrabbameini samanborið við eðlilega samanburðarhópa og tengdist jákvætt tjáningu glýkólýsuensímsins GAPDH. Fyrri rannsóknir hafa aðallega beinst að hlutverki niðurbrots tryptófans í að bæla niður ónæmissvörun gegn æxli40,41,42. Hér sýnum við fram á að hömlun á upptöku tryptófans með niðurbroti SLC7A5 í lungnakrabbameinsfrumum leiðir til síðari lækkunar á NAD gildum í frumufrumum og samhliða minnkunar á glýkólýsuvirkni. Í stuttu máli veitir rannsókn okkar líffræðilegan grundvöll fyrir breytingum á efnaskiptum í sermi sem tengjast illkynja umbreytingu lungnakirtilkrabbameins.
Stökkbreytingar í EGFR eru algengustu drifkraftsbreytingarnar hjá sjúklingum með NSCLC. Í rannsókn okkar komumst við að því að sjúklingar með EGFR stökkbreytingu (n = 41) höfðu svipaða efnaskiptaferla og sjúklingar með villta gerð EGFR (n = 31), þó að við fundum lækkuð sermisgildi hjá sumum sjúklingum með EGFR stökkbreytingu hjá sjúklingum með asýlkarnitín. Staðfest hlutverk asýlkarnitína er að flytja asýlhópa úr umfryminu inn í hvatberafylkið, sem leiðir til oxunar fitusýra til að framleiða orku 55. Í samræmi við niðurstöður okkar benti nýleg rannsókn einnig á svipaða efnaskiptaferla milli EGFR stökkbreytinga og villtra gerða EGFR æxla með því að greina heildarefnaskiptaferla 102 vefjasýna úr lungnakirtilkrabbameini 50. Athyglisvert er að asýlkarnitíninnihald fannst einnig í EGFR stökkbreytingahópnum. Því gæti verið rannsóknarefni frekar hvort breytingar á asýlkarnitíngildum endurspegli EGFR-völdum efnaskiptabreytingum og undirliggjandi sameindaferlum.
Að lokum setur rannsókn okkar fram flokkara fyrir sermisefnaskipti til að greina lungnahnúta og leggur til vinnuflæði sem getur hámarkað áhættumat og auðveldað klíníska meðferð byggða á tölvusneiðmyndatöku.
Þessi rannsókn var samþykkt af siðanefnd Krabbameinssjúkrahúss Sun Yat-sen háskólans, fyrsta tengda sjúkrahússins við Sun Yat-sen háskólann og siðanefnd Krabbameinssjúkrahúss Zhengzhou háskólans. Í rannsóknar- og innri staðfestingarhópunum voru 174 sermi frá heilbrigðum einstaklingum og 244 sermi frá góðkynja hnútum safnað frá einstaklingum sem gengust undir árlegar læknisskoðanir á krabbameinsvarnardeild Krabbameinsmiðstöðvar Sun Yat-sen háskólans og 166 góðkynja hnútar í sermi. Lungnakirtilkrabbamein á stigi I var safnað frá Krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans. Í ytri staðfestingarhópnum voru 48 tilfelli af góðkynja hnútum, 39 tilfelli af lungnakirtilkrabbameini á stigi I frá fyrsta tengda sjúkrahúsinu við Sun Yat-sen háskólann og 24 tilfelli af lungnakirtilkrabbameini á stigi I frá krabbameinssjúkrahúsinu í Zhengzhou. Krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans safnaði einnig 16 tilvikum af flöguþekjulungnakrabbameini á stigi I til að prófa greiningargetu viðurkennds efnaskiptaflokks (einkenni sjúklinga eru sýnd í viðbótartöflu 5). Sýni úr rannsóknarhópnum og innri staðfestingarhópnum voru tekin á milli janúar 2018 og maí 2020. Sýni úr ytri staðfestingarhópnum voru tekin á milli ágúst 2021 og október 2022. Til að lágmarka kynjahlutdrægni voru nokkurn veginn jafnmargir karlar og konur úthlutað í hvern hóp. Rannsóknarteymi og innra matsteymi. Kyn þátttakenda var ákvarðað út frá sjálfsmati. Upplýst samþykki var fengið frá öllum þátttakendum og engin bætur voru veittar. Þátttakendur með góðkynja hnúta voru þeir sem höfðu stöðuga sneiðmyndatökuskora eftir 2 til 5 ár á þeim tíma sem greiningin fór fram, fyrir utan eitt tilfelli úr ytri staðfestingarsýninu, sem var safnað fyrir aðgerð og greint með vefjameinafræði. Fyrir utan langvinna berkjubólgu. Tilfelli af lungnakrabbameini voru tekin fyrir lungnaaðgerð og staðfest með meinafræðilegri greiningu. Fastandi blóðsýni voru tekin í sermisaðskilnaðarrör án blóðþynningarlyfja. Blóðsýni voru storknuð í 1 klukkustund við stofuhita og síðan skiljuð við 2851 × g í 10 mínútur við 4°C til að safna sermisyfirborði. Sermissýni voru fryst við -80°C þar til umbrotsefnin voru dregin út. Krabbameinsvarnar- og læknisfræðilegrar skoðunardeild Krabbameinsmiðstöðvar Sun Yat-sen háskólans safnaði sermisafni frá 100 heilbrigðum gjöfum, þar á meðal jöfnum fjölda karla og kvenna á aldrinum 40 til 55 ára. Jöfn rúmmál af hverju gjafasýni voru blandað saman, safninu sem myndaðist var skipt í skammta og geymt við -80°C. Sermisblandan var notuð sem viðmiðunarefni fyrir gæðaeftirlit og gagnastöðlun.
Viðmiðunarsermi og prófsýni voru þíð og umbrotsefnin voru dregin út með samsettri útdráttaraðferð (MTBE/metanól/vatn) 56. Í stuttu máli voru 50 μl af sermi blandað saman við 225 μl af ísköldu metanóli og 750 μl af ísköldu metýl tert-bútýleter (MTBE). Hrærið í blöndunni og látið standa á ís í 1 klukkustund. Sýnin voru síðan blandað saman og hrist saman við 188 μl af MS-gráðu vatni sem innihélt innri staðla (13C-laktat, 13C3-pýrúvat, 13C-metíónín og 13C6-ísóleucín, keypt frá Cambridge Isotope Laboratories). Blandan var síðan skilvind við 15.000 × g í 10 mínútur við 4°C og neðri fasinn fluttur í tvö rör (125 μL hvort) fyrir LC-MS greiningu í jákvæðri og neikvæðri aðferð. Að lokum var sýnið gufað upp þar til það þornaði í hraðsogsþétti.
Þurrkuðu umbrotsefnin voru leyst upp í 120 μl af 80% asetónítríli, hrærð í vortex í 5 mínútur og skilvind við 15.000 × g í 10 mínútur við 4°C. Flotið var flutt í gulbrún glerhettuglös með örinnskotum fyrir efnaskiptarannsóknir. Ómarkviss efnaskiptagreining á öfgafullri vökvaskiljun með mikilli upplausn massagreiningar (UPLC-HRMS) palli. Umbrotsefnin voru aðskilin með Dionex Ultimate 3000 UPLC kerfi og ACQUITY BEH amíðsúlu (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Í jákvæðri jónastillingu voru hreyfanlegu fasarnir 95% (A) og 50% asetónítríl (B), hvor um sig innihélt 10 mmól/L af ammóníumasetati og 0,1% maurasýru. Í neikvæðri stillingu innihéldu hreyfanlegu fasarnir A og B 95% og 50% asetónítríl, hvor um sig, og báðir fasarnir innihéldu 10 mmól/L af ammóníumasetati, pH = 9. Stigalustubreytingin var eftirfarandi: 0–0,5 mín., 2% B; 0,5–12 mín., 2–50% B; 12–14 mín., 50–98% B; 14–16 mín., 98% B; 16–16,1 mín., 98–2% B; 16,1–20 mín., 2% B. Súlan var geymd við 40°C og sýnið við 10°C í sjálfvirka sýnatökutækinu. Flæðishraðinn var 0,3 ml/mín., inndælingarrúmmálið var 3 μl. Q-Exactive Orbitrap massagreinir (Thermo Fisher Scientific) með rafúðajónunargjafa (ESI) var keyrður í fullri skönnunarham og tengdur við ddMS2 eftirlitsham til að safna miklu magni af gögnum. MS breyturnar voru stilltar á eftirfarandi hátt: úðaspenna +3,8 kV/- 3,2 kV, háræðahitastig 320°C, hlífðargas 40 arb, hjálpargas 10 arb, hitastig rannsakandahitara 350°C, skönnunarsvið 70–1050 m/klst, upplausn 70.000. Gögnum var aflað með Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Til að meta gæði gagnanna voru gæðaeftirlitssýni (QC) búin til með því að fjarlægja 10 μL af ofanvökvanum úr hverju sýni. Sex gæðaeftirlitssýni voru greind í upphafi greiningarraðarinnar til að meta stöðugleika UPLC-MS kerfisins. Gæðaeftirlitssýni eru síðan sett reglulega inn í lotuna. Allar 11 loturnar af sermissýnum í þessari rannsókn voru greindar með LC-MS. Skammtar af sermisblöndu frá 100 heilbrigðum gjöfum voru notaðir sem viðmiðunarefni í viðkomandi lotum til að fylgjast með útdráttarferlinu og aðlaga fyrir áhrifum milli lota. Ómarkviss efnaskiptagreining á uppgötvunarhópnum, innri staðfestingarhópnum og ytri staðfestingarhópnum var framkvæmd við efnaskiptamiðstöð Sun Yat-sen háskólans. Ytri rannsóknarstofa Greiningar- og prófunarmiðstöðvar Tækniháskólans í Guangdong greindi einnig 40 sýni úr ytri hópnum til að prófa frammistöðu flokkunarlíkansins.
Eftir útdrátt og blöndun var algild magngreining á umbrotsefnum í sermi mæld með ultra-háafköstum vökvaskiljun-tandem massagreiningu (Agilent 6495 þrefaldur fjórpóll) með rafúðajónunargjafa (ESI) í margfeldi viðbragðsvöktunarham (MRM). ACQUITY BEH amíðsúla (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) var notuð til að aðskilja umbrotsefnin. Færanlega fasinn samanstóð af 90% (A) og 5% asetónítríli (B) með 10 mmól/L af ammóníumasetati og 0,1% ammóníaklausn. Stigatölukerfið var sem hér segir: 0–1,5 mín., 0% B; 1,5–6,5 mín., 0–15% B; 6,5–8 mín., 15% B; 8–8,5 mín., 15%–0% B; 8,5–11,5 mín., 0%B. Súlan var haldið við 40°C og sýnið við 10°C í sjálfvirka sýnatökutækinu. Flæðishraðinn var 0,3 ml/mín. og inndælingarrúmmálið var 1 μL. MS breytur voru stilltar á eftirfarandi hátt: háræðaspenna ±3,5 kV, þrýstingur í úðatæki 35 psi, slíðurgasflæði 12 L/mín., slíðurgashitastig 350°C, þurrkunargashitastig 250°C og þurrkunargasflæði 14 l/mín. MRM umbreytingar tryptófans, pýrúvats, laktats, hýpóxantíns og xantíns voru 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 og 151,0–107,9, talið í sömu röð. Gögnum var safnað með Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Fyrir sermissýni voru tryptófan, pýrúvat, laktat, hýpóxantín og xantín magngreind með kvörðunarkúrfum staðlaðra blöndulausna. Fyrir frumusýni var tryptófaninnihald staðlað miðað við innri staðal og próteinmassa frumnanna.
Útdráttur hámarks (m/z og varðveislutími (RT)) var framkvæmdur með Compound Discovery 3.1 og TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Til að útiloka hugsanlegan mismun milli lota var hverjum einkennandi toppi prófunarsýnisins deilt með einkennandi toppi viðmiðunarefnisins úr sömu lotu til að fá hlutfallslegt magn. Hlutfallsleg staðalfrávik innri staðla fyrir og eftir stöðlun eru sýnd í viðbótartöflu 6. Mismunur á milli hópanna tveggja var einkenndur með fölskum uppgötvunartíðni (FDR < 0,05, Wilcoxon signed rank test) og margföldunarbreytingu (> 1,2 eða < 0,83). Óunnin MS gögn um útdregnu eiginleikana og viðmiðunar sermisleiðrétt MS gögn eru sýnd í viðbótargögnum 1 og viðbótargögnum 2, talið í sömu röð. Skýring hámarka var framkvæmd út frá fjórum skilgreindum stigum auðkenningar, þar á meðal auðkenndum umbrotsefnum, hugsanlega skýrðum efnasamböndum, hugsanlega einkenndum efnasamböndaflokkum og óþekktum efnasamböndum 22. Byggt á gagnagrunnsleitum í Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) voru líffræðileg efnasambönd með MS/MS samsvörun í staðfestum stöðlum eða nákvæmri samsvörun í mzCloud (stig > 85) eða Chemspider að lokum valin sem milliefni milli mismunandi umbrotsefna. Hámarksskýringar fyrir hvert einkenni eru innifaldar í viðbótargögnum 3. MetaboAnalyst 5.0 var notað fyrir einþátta greiningu á summustaðlaðri magni umbrotsefna. MetaboAnalyst 5.0 mat einnig KEGG ferilsauðgunargreiningu byggða á marktækt mismunandi umbrotsefnum. Aðalþáttagreining (PCA) og aðgreiningargreining með minnstu kvaðrata aðgreiningu (PLS-DA) voru greind með ropls hugbúnaðarpakkanum (útg. 1.26.4) með staflastöðlun og sjálfvirkri kvarðastærð. Besta umbrotsefnalífmerkjalíkanið til að spá fyrir um illkynja æxli í hnútum var búið til með tvíundaraðhvarfsgreiningu með minnstu algildri rýrnun og valvirkja (LASSO, R pakki útg. 4.1-3). Frammistaða aðgreiningarlíkansins í greiningar- og staðfestingarsettunum var lýst með því að meta AUC byggt á ROC greiningu samkvæmt pROC pakkanum (útg. 1.18.0.). Besta líkindamörkin voru fengin út frá hámarks Youden vísitölu líkansins (næmi + sértækni – 1). Sýni með gildi lægri eða hærri en þröskuldinn verða spáð sem góðkynja hnútar og lungnakirtilkrabbamein, talið í sömu röð.
A549 frumur (#CCL-185, American Type Culture Collection) voru ræktaðar í F-12K miðli sem innihélt 10% FBS. Stuttar hárnálar RNA (shRNA) raðir sem miða á SLC7A5 og ómarkvissa samanburðarröð (NC) voru settar inn í lentiveiru vektorinn pLKO.1-puro. Mótefnisraðir shSLC7A5 eru eftirfarandi: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Mótefni gegn SLC7A5 (#5347) og túbúlíni (#2148) voru keypt frá Cell Signaling Technology. Mótefni gegn SLC7A5 og túbúlíni voru notuð í þynningu 1:1000 fyrir Western blot greiningu.
Seahorse XF glýkólýtískt álagspróf mælir utanfrumusýrustig (ECAR). Í prófinu voru glúkósi, oligomycin A og 2-DG gefin í röð til að prófa glýkólýsugetu frumna eins og mælt var með ECAR.
A549 frumur, sem voru erfðabreyttar með ómarkvissri samanburðarfrumu (NC) og shSLC7A5 (Sh1, Sh2), voru settar í skálar yfir nótt með 10 cm þvermál. Frumuefnabrotsefni voru dregin út með 1 ml af ísköldu 80% vatnskenndu metanóli. Frumur í metanóllausninni voru skafaðar af, safnað í nýtt rör og skilvindaðar við 15.000 × g í 15 mínútur við 4°C. Safnið 800 µl af ofanvökva og þurrkið með hraðsogsþétti. Þurrkuðu efnabrotsefnispellurnar voru síðan greindar fyrir tryptófanmagn með LC-MS/MS eins og lýst er hér að ofan. Frumu-NAD(H) magn í A549 frumum (NC og shSLC7A5) var mælt með megindlegu NAD+/NADH litrófsmælingarsetti (#K337, BioVision) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Próteinmagn var mælt fyrir hvert sýni til að staðla magn efnabrotsefna.
Engar tölfræðilegar aðferðir voru notaðar til að ákvarða úrtaksstærðina fyrirfram. Fyrri rannsóknir á efnaskiptafræði sem miðuðu að því að finna lífmerki15,18 hafa verið notaðar sem viðmið fyrir stærðarákvörðun og samanborið við þessar skýrslur var úrtakið okkar fullnægjandi. Engin sýni voru útilokuð úr rannsóknarhópnum. Sermissýni voru handahófskennt úthlutað í uppgötvunarhóp (306 tilfelli, 74,6%) og innri staðfestingarhóp (104 tilfelli, 25,4%) fyrir ómarkvissar efnaskiptafræðirannsóknir. Við völdum einnig handahófskennt 70 tilfelli úr hverjum hópi úr uppgötvunarsettinu fyrir markvissar efnaskiptafræðirannsóknir. Rannsakendurnir voru blindaðir fyrir hópaskiptingu við LC-MS gagnasöfnun og greiningu. Tölfræðilegar greiningar á efnaskiptafræðigögnum og frumutilraunum eru lýstar í viðkomandi köflum Niðurstöður, Myndaskýringar og Aðferðir. Magnbundin ákvörðun á frumutryptófani, NADT og glýkólýsuvirkni var framkvæmd þrisvar sinnum óháð hvoru með eins niðurstöðum.
Nánari upplýsingar um rannsóknarsnið er að finna í útdrætti skýrslunnar um náttúrulegt eignasafn sem fylgir þessari grein.
Óunnin MS gögn úr útdregnum eiginleikum og staðluð MS gögn úr viðmiðunarserminu eru sýnd í viðbótargögnum 1 og viðbótargögnum 2, talið í sömu röð. Skýringar á hámarki fyrir mismunandi eiginleika eru kynntar í viðbótargögnum 3. Hægt er að hlaða niður LUAD TCGA gagnasafninu af https://portal.gdc.cancer.gov/. Inntaksgögnin fyrir teikningu grafsins eru í upprunagögnunum. Upprunagögn eru gefin fyrir þessa grein.
Rannsóknarhópur um lungnaskimun o.fl. Að draga úr dánartíðni af völdum lungnakrabbameins með lágskammta tölvusneiðmyndatöku. Norður-England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR og Prophet, PC. Skimun fyrir lungnakrabbameini með lágskammta spíral-tölvusneiðmynd: niðurstöður úr Þjóðlegu lungnaskimunarrannsókninni (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, o.fl. Að draga úr dánartíðni af völdum lungnakrabbameins með rúmmáls-CT skimun í slembiraðaðri rannsókn. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Birtingartími: 18. september 2023