Mismunagreining á lungnahnútum sem greindir eru með tölvusneiðmynd (CT) er enn áskorun í klínískri starfsemi.Hér auðkennum við alþjóðlegt umbrot 480 sermissýna, þar á meðal heilbrigða viðmiðunarhópa, góðkynja lungnahnúta og stig I lungnakirtilkrabbameins.Kirtilkrabbamein sýna einstaka efnaskiptasnið, en góðkynja hnúðar og heilbrigðir einstaklingar hafa mikla líkindi í efnaskiptasniði.Í uppgötvunarhópnum (n = 306) voru 27 umbrotsefni greind til að greina á milli góðkynja og illkynja hnúða.AUC fyrir mismununarlíkanið í hópnum með innri sannprófun (n = 104) og ytri sannprófun (n = 111) var 0,915 og 0,945, í sömu röð.Ferðagreining leiddi í ljós aukin glýkólýsandi umbrotsefni sem tengdust minnkuðu tryptófani í kirtilkrabbameinssermi í lungum samanborið við góðkynja hnúða og heilbrigða viðmiðunarhópa og benti til þess að upptaka tryptófans stuðlaði að glýkólýsu í lungnakrabbameinsfrumum.Rannsókn okkar undirstrikar gildi lífmerkja umbrotsefna í sermi við mat á hættu á lungnahnútum sem greinast með CT.
Snemma greining er mikilvæg til að bæta lifun krabbameinssjúklinga.Niðurstöður úr bandarísku National Lung Cancer Screening Trial (NLST) og evrópsku NELSON rannsókninni hafa sýnt að skimun með lágskammta tölvusneiðmynd (LDCT) getur dregið verulega úr lungnakrabbameinsdauða í áhættuhópum1,2,3.Eftir útbreidd notkun LDCT til lungnakrabbameinsleitar hefur tíðni tilfallandi röntgenrannsókna á einkennalausum lungnahnútum haldið áfram að aukast 4 .Lungnahnúðar eru skilgreindir sem brennisteinsógagnsæi allt að 3 cm í þvermál 5 .Við stöndum frammi fyrir erfiðleikum við að meta líkur á illkynja sjúkdómi og takast á við þann mikla fjölda lungnahnúta sem greindust fyrir tilviljun á LDCT.Takmarkanir tölvusneiðmynda geta leitt til tíðra eftirfylgniskoðana og rangt-jákvæðra niðurstaðna, sem leiðir til óþarfa inngripa og ofmeðferðar6.Þess vegna er þörf á að þróa áreiðanleg og gagnleg lífmerki til að bera kennsl á lungnakrabbamein rétt á fyrstu stigum og aðgreina flesta góðkynja hnúða við fyrstu greiningu 7 .
Alhliða sameindagreining á blóði (sermi, plasma, einkjarna frumum í útlægum blóði), þar á meðal erfðafræði, próteinfræði eða DNA metýleringu8,9,10, hefur leitt til vaxandi áhuga á uppgötvun lífmerkja til greiningar á lungnakrabbameini.Á sama tíma mæla efnaskiptaaðferðir frumuafurðir sem eru undir áhrifum innrænna og utanaðkomandi aðgerða og er því beitt til að spá fyrir um upphaf og útkomu sjúkdóma.Vökvaskiljun-tandem massagreining (LC-MS) er mikið notuð aðferð við efnaskiptafræðirannsóknir vegna mikillar næmni og stórs hreyfisviðs, sem getur náð yfir umbrotsefni með mismunandi eðlisefnafræðilega eiginleika11,12,13.Þrátt fyrir að alþjóðleg efnaskiptagreining á plasma/sermi hafi verið notuð til að bera kennsl á lífmerki sem tengjast greiningu lungnakrabbameins14,15,16,17 og meðferðarvirkni, á enn eftir að rannsaka 18 umbrotsefnisflokka í sermi til að greina á milli góðkynja og illkynja lungnahnúta.-mikil rannsókn.
Kirtilkrabbamein og flöguþekjukrabbamein eru tvær helstu undirgerðir lungnakrabbameins sem ekki er smáfrumukrabbamein (NSCLC).Ýmsar tölvusneiðmyndarannsóknir benda til þess að kirtilkrabbamein sé algengasta vefjafræðilega gerð lungnakrabbameins1,19,20,21.Í þessari rannsókn notuðum við ofurafkastamikil vökvaskiljun-háupplausnarmassagreiningu (UPLC-HRMS) til að framkvæma efnaskiptagreiningu á samtals 695 sermissýnum, þar á meðal heilbrigðum viðmiðunarhópum, góðkynja lungnahnútum og CT-greindum ≤3 cm.Skimun fyrir stig I lungnakirtilkrabbameins.Við fundum hóp umbrotsefna í sermi sem aðgreina kirtilkrabbamein í lungum frá góðkynja hnúðum og heilbrigðum viðmiðunarhópum.Greining á leiðaauðgun leiddi í ljós að óeðlileg umbrot tryptófans og glúkósa eru algengar breytingar á kirtilkrabbameini í lungum samanborið við góðkynja hnúða og heilbrigða viðmiðunarhópa.Að lokum komum við á og staðfestum efnaskiptaflokkara í sermi með mikilli sérhæfni og næmni til að greina á milli illkynja og góðkynja lungnahnúta sem greindust með LDCT, sem getur aðstoðað við snemmtæka mismunagreiningu og áhættumat.
Í núverandi rannsókn var kyn- og aldurssamhæfðum sermisýnum safnað afturvirkt úr 174 heilbrigðum viðmiðunarhópum, 292 sjúklingum með góðkynja lungnahnúta og 229 sjúklingum með stig I lungnakirtilkrabbamein.Lýðfræðileg einkenni 695 einstaklinganna eru sýnd í viðbótartöflu 1.
Eins og sýnt er á mynd 1a var alls 480 sermissýnum, þar á meðal 174 heilbrigðum samanburðarsýnum (HC), 170 góðkynja hnúðum (BN) og 136 stigs I lungnakirtilkrabbameini (LA) sýnum, safnað í Sun Yat-sen háskólans krabbameinsstöð.Uppgötvunarhópur fyrir ómarkvissan efnaskiptaprófíl með ofurafkastamikilli vökvaskiljun-háupplausnarmassagreiningu (UPLC-HRMS).Eins og sýnt er á viðbótarmynd 1 voru mismunaumbrotsefni milli LA og HC, LA og BN auðkennd til að koma á flokkunarlíkani og kanna frekar mismunaferlisgreiningu.104 sýni sem safnað var af krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans og 111 sýnum sem safnað var af tveimur öðrum sjúkrahúsum voru gefin innri og ytri staðfestingu, í sömu röð.
Rannsóknarþýði í uppgötvunarhópnum sem gekkst undir alþjóðlega efnaskiptagreiningu í sermi með því að nota ultra-performance vökvaskiljun-háupplausnarmassagreiningu (UPLC-HRMS).b Aðgreiningargreining að hluta (PLS-DA) á heildarumbroti 480 sermissýna úr rannsóknarhópnum, þar á meðal heilbrigðum samanburðarhópum (HC, n = 174), góðkynja hnúða (BN, n = 170) og kirtilkrabbamein á stigi I í lungum (Los Angeles, n = 136).+ESI, jákvæð rafúðajónunarstilling, -ESI, neikvæð rafúðajónunarstilling.c–e Umbrotsefni með marktækt mismunandi magn í tveimur gefnum hópum (tvíhliða Wilcoxon signed ranking próf, rangar uppgötvunartíðni leiðrétt p gildi, FDR <0,05) eru sýnd í rauðu (falt breyting > 1,2) og bláu (falt breyting < 0,83) .) sýnt á eldfjallagrafíkinni.f Stigveldis þyrpingarhitakort sem sýnir verulegan mun á fjölda merktra umbrotsefna milli LA og BN.Upprunagögn eru veitt í formi frumgagnaskráa.
Heildarumbrot í sermi 174 HC, 170 BN og 136 LA í uppgötvunarhópnum var greint með UPLC-HRMS greiningu.Við sýnum fyrst að gæðaeftirlit (QC) sýni hópast þétt í miðju óeftirlitslausrar aðalhlutagreiningar (PCA) líkans, sem staðfestir stöðugleika frammistöðu núverandi rannsóknar (viðbótarmynd 2).
Eins og sýnt er í greiningunni á minnstu ferningum að hluta (PLS-DA) á mynd 1 b, komumst við að því að það var skýr munur á LA og BN, LA og HC í jákvæðum (+ESI) og neikvæðum (-ESI) rafúðajónunarhamum .einangrað.Hins vegar fannst enginn marktækur munur á BN og HC við +ESI og -ESI aðstæður.
Við fundum 382 mismunandi eiginleika á milli LA og HC, 231 mismunareiginleika á milli LA og BN, og 95 mismunandi eiginleika milli BN og HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 og multiple change>1.2 eða <0.83) (Mynd .1c-e) )..Toppar voru skýrðir frekar (viðbótargögn 3) á móti gagnagrunni (mzCloud/HMDB/Chemspider bókasafn) með m/z gildi, varðveislutíma og sundrunarmassarófsleit (upplýsingar lýst í kaflanum um aðferðir) 22 .Að lokum fundust 33 og 38 umbrotsefni með merkingu með marktækum mun á magni fyrir LA á móti BN (Mynd 1f og viðbótartafla 2) og LA á móti HC (viðbótarmynd 3 og viðbótartafla 2), í sömu röð.Aftur á móti greindust aðeins 3 umbrotsefni með marktækan mun á magni í BN og HC (viðbótartafla 2), í samræmi við skörun BN og HC í PLS-DA.Þessi mismunandi umbrotsefni ná yfir mikið úrval lífefna (viðbótarmynd 4).Samanlagt sýna þessar niðurstöður marktækar breytingar á umbrotum í sermi sem endurspegla illkynja umbreytingu á lungnakrabbameini á byrjunarstigi samanborið við góðkynja lungnahnúða eða heilbrigða einstaklinga.Á sama tíma bendir líkt umbrotsefni BN og HC í sermi til þess að góðkynja lungnahnúðar geti deilt mörgum líffræðilegum einkennum með heilbrigðum einstaklingum.Í ljósi þess að genabreytingar í húðþekjuvaxtarþáttaviðtaka (EGFR) eru algengar í kirtilkrabbameini í lungum undirgerð 23, leituðum við að því að ákvarða áhrif stökkbreytinga á drifum á efnaskipti í sermi.Við greindum síðan heildar efnaskiptaferil 72 tilfella með EGFR stöðu í kirtilkrabbameinshópnum í lungum.Athyglisvert er að við fundum sambærilega snið milli EGFR stökkbreyttra sjúklinga (n = 41) og EGFR villigerðarsjúklinga (n = 31) í PCA greiningu (viðbótarmynd 5a).Hins vegar fundum við 7 umbrotsefni þar sem magn þeirra var marktækt breytt hjá sjúklingum með EGFR stökkbreytingu samanborið við sjúklinga með villigerð EGFR (t próf, p < 0,05 og faltbreyting > 1,2 eða < 0,83) (viðbótarmynd 5b).Meirihluti þessara umbrotsefna (5 af 7) eru asýlkarnitín, sem gegna mikilvægu hlutverki í oxunarferlum fitusýru.
Eins og sýnt er í verkflæðinu sem sýnt er á mynd 2 a, voru lífmerki fyrir flokkun hnúta fengin með því að nota minnst algera rýrnun og val byggt á 33 mismunaumbrotsefnum auðkennd í LA (n = 136) og BN (n = 170).Besta samsetning breytna (LASSO) – tvöfaldur logistic aðhvarfslíkan.Notuð var tíföld krossgilding til að prófa áreiðanleika líkansins.Breytuval og reglustilling færibreytu er stillt með líkindahámörkunarvíti með færibreytunni λ24.Alþjóðleg efnaskiptagreining var frekar framkvæmd óháð í hópum innri löggildingar (n = 104) og ytri sannprófunar (n = 111) til að prófa flokkunarframmistöðu mismununarlíkanssins.Fyrir vikið voru 27 umbrotsefni í uppgötvunarsettinu auðkennd sem besta aðgreiningarlíkanið með stærsta meðaltal AUC gildi (Mynd 2b), þar á meðal 9 höfðu aukna virkni og 18 minnkað virkni í LA samanborið við BN (Mynd 2c).
Vinnuflæði til að byggja upp lungnahnútaflokkara, þar á meðal að velja besta spjaldið af umbrotsefnum í sermi í uppgötvunarsettinu með því að nota tvöfalda flutningsaðhvarfslíkan með tífaldri krossfullgildingu og meta forspárárangur í innri og ytri staðfestingarsettum.b Krossstaðfestingartölfræði LASSO aðhvarfslíkans fyrir val á efnaskiptalífmerkjum.Tölurnar sem gefnar eru upp hér að ofan tákna meðalfjölda lífmerkja sem valdir eru við tiltekið λ.Rauða punktalínan táknar meðaltal AUC gildi við samsvarandi lambda.Gráar villustikur tákna lágmarks- og hámarksgildi AUC.Punktalínan gefur til kynna besta líkanið með 27 völdum lífmerkjum.AUC, flatarmál undir rekstrareinkennum móttakara (ROC) ferilsins.c Brotbreytingar á 27 völdum umbrotsefnum í LA hópnum samanborið við BN hópinn í uppgötvunarhópnum.Rauður dálkur – virkjun.Blái súlan er hnignun.d–f Receiver operating characteristic (ROC) ferlar sem sýna kraft mismununarlíkans sem byggir á 27 samsetningum umbrotsefna í uppgötvunar-, innri og ytri löggildingarsettum.Upprunagögn eru veitt í formi frumgagnaskráa.
Spálíkan var búið til byggt á vegnum aðhvarfsstuðlum þessara 27 umbrotsefna (viðbótartafla 3).ROC greining byggð á þessum 27 umbrotsefnum gaf svæði undir ferlinum (AUC) gildi 0,933, næmi uppgötvunarhóps var 0,868 og sértækni var 0,859 (mynd 2d).Á meðan, meðal 38 merktra mismunaumbrotsefna á milli LA og HC, náði mengi 16 umbrotsefna AUC 0,902 með næmi 0,801 og sértækni 0,856 við að greina LA frá HC (viðbótarmynd 6a-c).Einnig voru borin saman AUC gildi byggð á mismunandi skiptaþröskuldum fyrir mismunandi umbrotsefni.Við komumst að því að flokkunarlíkanið virkaði best við að greina á milli LA og BN (HC) þegar fallbreytingarstigið var stillt á 1,2 á móti 1,5 eða 2,0 (viðbótarmynd 7a,b).Flokkunarlíkanið, byggt á 27 umbrotsefnahópum, var staðfest frekar í innri og ytri hópum.AUC var 0,915 (næmi 0,867, sértækni 0,811) fyrir innri staðfestingu og 0,945 (næmi 0,810, sérhæfni 0,979) fyrir ytri sannprófun (mynd 2e, f).Til að meta skilvirkni rannsóknastofnana voru 40 sýni úr ytri hópnum greind á ytri rannsóknarstofu eins og lýst er í kaflanum um Aðferðir.Flokkunarnákvæmni náði AUC upp á 0,925 (viðbótarmynd 8).Vegna þess að flöguþekjukrabbamein í lungum (LUSC) er næstalgengasta undirtegund lungnakrabbameins sem ekki er af smáfrumugerð (NSCLC) á eftir kirtilkrabbameini í lungum (LUAD), prófuðum við einnig fullgilt hugsanlegt notagildi efnaskiptasniða.BN og 16 tilfelli LUSC.AUC mismununar á milli LUSC og BN var 0,776 (aukamynd 9), sem gefur til kynna lakari getu samanborið við mismunun á milli LUAD og BN.
Rannsóknir hafa sýnt að stærð hnúta á tölvusneiðmyndum er jákvæð fylgni við líkurnar á illkynja sjúkdómi og er áfram aðalákvörðun um hnútameðferð25,26,27.Greining á gögnum úr stórum hópi NELSON skimunarrannsóknarinnar sýndi að hættan á illkynja sjúkdómi hjá einstaklingum með hnúta <5 mm var jafnvel svipuð og hjá einstaklingum án hnúta 28 .Þess vegna er lágmarksstærð sem krefst reglubundins tölvusneiðmyndaeftirlits 5 mm, eins og British Thoracic Society (BTS) mælir með, og 6 mm, eins og Fleischner Society mælir með 29 .Hins vegar eru hnúðar stærri en 6 mm og án augljósrar góðkynja einkenna, kallaðir óákveðnir lungnahnúðar (IPN), áfram mikil áskorun í mati og stjórnun í klínískri starfsemi30,31.Næst skoðuðum við hvort hnútastærð hefði áhrif á efnaskiptaeinkenni með því að nota sameinuð sýni úr uppgötvunar- og innri staðfestingarhópnum.Með því að einbeita okkur að 27 fullgiltum lífmerkjum, bárum við fyrst saman PCA snið HC og BN undir-6 mm umbrotsefna.Við komumst að því að flestir gagnapunktar fyrir HC og BN skarast, sem sýnir að umbrotsefnisþéttni í sermi var svipuð í báðum hópum (mynd 3a).Eiginleikakortin yfir mismunandi stærðarsvið héldust varðveitt í BN og LA (mynd 3b, c), en aðskilnaður sást á milli illkynja og góðkynja hnúða á bilinu 6–20 mm (mynd 3d).Þessi hópur hafði AUC 0,927, sértækni 0,868 og næmi 0,820 til að spá fyrir um illkynja hnúta sem mældust 6 til 20 mm (mynd 3e, f).Niðurstöður okkar sýna að flokkarinn getur fanga efnaskiptabreytingar af völdum snemma illkynja umbreytinga, óháð stærð hnúta.
ad Samanburður á PCA sniðum milli tiltekinna hópa byggt á efnaskiptaflokkara 27 umbrotsefna.CC og BN < 6 mm.b BN < 6 mm á móti BN 6–20 mm.í LA 6–20 mm á móti LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm og LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) ferill sem sýnir frammistöðu líkansins fyrir hnúða 6–20 mm.f Líkindagildi voru reiknuð út frá logistic aðhvarfslíkani fyrir hnúða sem mældust 6–20 mm.Gráa punktalínan táknar ákjósanlegasta niðurskurðargildið (0,455).Tölurnar hér að ofan tákna hlutfall mála sem spáð er fyrir Los Angeles.Notaðu tvíhliða t próf nemenda.PCA, aðalþáttagreining.AUC svæði undir ferlinum.Upprunagögn eru veitt í formi frumgagnaskráa.
Fjögur sýni (á aldrinum 44-61 ára) með svipaða stærð lungnahnúta (7-9 mm) voru valin frekar til að sýna frammistöðu fyrirhugaðs illkynja spálíkans (mynd 4a, b).Við fyrstu skimun kom tilvik 1 fram sem fastur hnúður með kölkun, einkenni sem tengist góðkynja, en tilvik 2 sýndi sig sem óákveðinn að hluta til solidan hnút án augljósa góðkynja eiginleika.Þrjár umferðir af eftirfylgni tölvusneiðmynda sýndu að þessi tilvik héldust stöðug yfir 4 ára tímabil og voru því talin góðkynja hnúðar (mynd 4a).Í samanburði við klínískt mat á sneiðmyndatöku í röð, greindi einskota umbrotsefnisgreiningu í sermi með núverandi flokkunarlíkani fljótt og rétt þessa góðkynja hnúða á grundvelli líkindaþvingana (tafla 1).Mynd 4b í tilviki 3 sýnir hnúð með merki um samdrátt í fleiðru, sem oftast tengist illkynja sjúkdómi32.Tilfelli 4 sett fram sem óákveðinn að hluta til solid hnúður án vísbendinga um góðkynja orsök.Spáð var fyrir um öll þessi tilvik sem illkynja samkvæmt flokkunarlíkaninu (tafla 1).Sýnt var fram á mat á kirtilkrabbameini í lungum með vefjameinafræðilegri skoðun eftir lungnaskurðaðgerð (mynd 4b).Fyrir ytri löggildingarsettið spáði efnaskiptaflokkarinn nákvæmlega fyrir um tvö tilvik óákveðinna lungnahnúta stærri en 6 mm (viðbótarmynd 10).
Sneiðmyndamyndir af axial glugga lungna tveggja tilfella góðkynja hnúða.Í tilviki 1 sýndi tölvusneiðmynd eftir 4 ár stöðugan fastan hnút sem mældist 7 mm með kölkun í hægra neðri hluta blaðsins.Í tilviki 2 leiddi tölvusneiðmynd eftir 5 ár í ljós stöðugan, að hluta til solidan hnúð með 7 mm þvermál í hægra efri hluta blaðsins.b Axial glugga CT myndir af lungum og samsvarandi meinafræðilegar rannsóknir á tveimur tilfellum kirtilkrabbameins á stigi I fyrir lungnabrottnám.Tilfelli 3 leiddi í ljós hnút með þvermál 8 mm í hægra efri blaðblaðinu með fleiðru afturköllun.Tilfelli 4 leiddi í ljós að hluta til solid slípað gler hnút sem mældist 9 mm í efri vinstra blaðinu.Hematoxýlín og eósín (H&E) litun á skornum lungnavef (kvarðastika = 50 μm) sem sýnir kirtilkrabbamein í lungum.Örvar gefa til kynna hnúða sem greindust á tölvusneiðmyndum.H&E myndir eru dæmigerðar myndir af mörgum (>3) smásæjum sem meinafræðingur skoðar.
Samanlagt sýna niðurstöður okkar hugsanlegt gildi umbrotsefna lífmerkja í sermi við mismunagreiningu á lungnahnútum, sem geta valdið áskorunum við mat á sneiðmyndatöku.
Byggt á viðurkenndum efnaskiptaefnahópi með mismunandi umbrotsefnum, leituðum við að bera kennsl á líffræðilega fylgni helstu efnaskiptabreytinga.KEGG ferli auðgunargreiningar af MetaboAnalyst benti á 6 algengar verulega breyttar leiðir milli þessara tveggja hópa (LA vs. HC og LA vs. BN, leiðrétt p ≤ 0,001, áhrif > 0,01).Þessar breytingar einkenndust af truflunum á umbrotum pýrúvats, umbrotum tryptófans, umbrotum níasíns og nikótínamíðs, glýkólýsu, TCA hringrásarinnar og umbrots púríns (mynd 5a).Við framkvæmdum síðan markvissa efnaskiptafræði til að sannreyna meiriháttar breytingar með því að nota algera magngreiningu.Ákvörðun algengra umbrotsefna í algengum breyttum ferlum með þrefaldri fjórpóla massagreiningu (QQQ) með ósviknum umbrotsstöðlum.Lýðfræðilegir eiginleikar marksýnis efnaskiptarannsóknarinnar eru innifalin í viðbótartöflu 4. Í samræmi við alþjóðlegar niðurstöður um efnaskiptafræði, staðfesti megindleg greining að hýpoxantín og xantín, pýruvat og laktat hækkuðu í LA samanborið við BN og HC (mynd 5b, c, p <0,05).Hins vegar fannst enginn marktækur munur á þessum umbrotsefnum á milli BN og HC.
KEGG ferli auðgunargreiningar á marktækt mismunandi umbrotsefnum í LA hópnum samanborið við BN og HC hópana.Tvíhliða Globaltest var notað og p gildi voru leiðrétt með Holm-Bonferroni aðferðinni (leiðrétt p ≤ 0,001 og áhrifastærð > 0,01).b–d fiðlulotur sem sýna magn af hypoxantín, xantín, laktat, pýrúvat og tryptófan í sermi HC, BN og LA ákvarðað með LC-MS/MS (n = 70 á hóp).Hvítar og svartar punktalínur gefa til kynna miðgildi og fjórðungslínur, í sömu röð.e Fiðlurit sem sýnir eðlilega Log2TPM (afrit á milljón) mRNA tjáningu á SLC7A5 og QPRT í kirtilkrabbameini í lungum (n = 513) samanborið við eðlilegan lungnavef (n = 59) í LUAD-TCGA gagnasafninu.Hvíti reiturinn táknar millifjórðungsbilið, lárétta svarta línan í miðjunni táknar miðgildið og lóðrétta svarta línan sem nær frá reitnum táknar 95% öryggisbil (CI).f Pearson fylgnirit um SLC7A5 og GAPDH tjáningu í kirtilkrabbameini í lungum (n = 513) og eðlilegum lungnavef (n = 59) í TCGA gagnasafninu.Gráa svæðið táknar 95% CI.r, Pearson fylgnistuðull.g Stöðluð frumumagn tryptófans í A549 frumum sem eru umbreyttar með ósértækri shRNA-stýringu (NC) og shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ákvarðað með LC-MS/MS.Kynnt er tölfræðileg greining á fimm líffræðilega óháðum sýnum í hverjum hópi.h Frumumagn NADt (heildar NAD, þar á meðal NAD+ og NADH) í A549 frumum (NC) og SLC7A5 knockdown A549 frumum (Sh1, Sh2).Kynnt er tölfræðileg greining á þremur líffræðilega óháðum sýnum í hverjum hópi.i Sykursýkandi virkni A549 frumna fyrir og eftir SLC7A5 niðurfellingu var mæld með utanfrumu súrnunarhraða (ECAR) (n = 4 líffræðilega óháð sýni í hverjum hóp).2-DG,2-deoxý-D-glúkósa.Tvíhliða t próf nemenda var notað í (b–h).Í (g–i) tákna villustikur meðaltal ± SD, hver tilraun var gerð þrisvar sinnum sjálfstætt og niðurstöðurnar voru svipaðar.Upprunagögn eru veitt í formi frumgagnaskráa.
Með hliðsjón af verulegum áhrifum breyttra tryptófansefnaskipta í LA hópnum, metum við einnig sermismagn tryptófans í HC, BN og LA hópunum með því að nota QQQ.Við komumst að því að tryptófan í sermi minnkaði í LA samanborið við HC eða BN (p < 0,001, mynd 5d), sem er í samræmi við fyrri niðurstöður um að magn tryptófans í blóðrás er lægra hjá sjúklingum með lungnakrabbamein en í heilbrigðum viðmiðunarhópi úr samanburðarhópnum33,34 ,35.Önnur rannsókn sem notaði PET/CT sporefni 11C-metýl-L-tryptófan leiddi í ljós að varðveislutími tryptófansmerkja í lungnakrabbameinsvef var verulega aukinn samanborið við góðkynja sár eða eðlilegan vef36.Við gerum ráð fyrir að minnkun tryptófans í LA sermi gæti endurspeglað virka tryptófanupptöku í lungnakrabbameinsfrumum.
Það er einnig vitað að lokaafurð kynurenínferils tryptófansbrots er NAD+37,38, sem er mikilvægt hvarfefni fyrir hvarf glýseraldehýðs-3-fosfats við 1,3-bisfosfóglýserat í glýkólýsu39.Þó fyrri rannsóknir hafi beinst að hlutverki niðurbrots tryptófans í ónæmisstjórnun, reyndum við að skýra samspilið á milli truflunar á tryptófans og glýkólýsandi ferla sem sést í þessari rannsókn.Vitað er að flutningsefnisfjölskylda 7 meðlimur 5 (SLC7A5) er tryptófan flutningsmaður43,44,45.Kínólínsýra fosfóríbósýltransferasi (QPRT) er ensím staðsett neðan við kynurenín leiðina sem breytir kínólínsýru í NAMN46.Skoðun á LUAD TCGA gagnapakkanum leiddi í ljós að bæði SLC7A5 og QPRT voru marktækt uppstýrt í æxlisvef samanborið við eðlilegan vef (mynd 5e).Þessi aukning kom fram á stigum I og II sem og stigum III og IV kirtilkrabbameins í lungum (viðbótarmynd 11), sem gefur til kynna snemma truflanir á umbrotum tryptófans sem tengjast æxlismyndun.
Að auki sýndi LUAD-TCGA gagnasafnið jákvæða fylgni milli SLC7A5 og GAPDH mRNA tjáningar í sýnum krabbameinssjúklinga (r = 0,45, p = 1,55E-26, mynd 5f).Aftur á móti fannst engin marktæk fylgni milli slíkra genamerkja í eðlilegum lungnavef (r = 0,25, p = 0,06, mynd 5f).Niðurfelling á SLC7A5 (viðbótarmynd 12) í A549 frumum dró verulega úr frumu tryptófani og NAD(H) gildum (Mynd 5g,h), sem leiddi til veiklaðrar glýkólýtískrar virkni sem mæld er með utanfrumu súrnunarhraða (ECAR) (Mynd 1).5i).Þannig, byggt á efnaskiptabreytingum í sermi og in vitro uppgötvun, gerum við tilgátu um að tryptófan umbrot geti framleitt NAD+ í gegnum kynurenine leiðina og gegnt mikilvægu hlutverki við að stuðla að glýkólýsu í lungnakrabbameini.
Rannsóknir hafa sýnt að mikill fjöldi óákveðinna lungnahnúta sem greinast með LDCT getur leitt til þess að þörf sé á viðbótarprófum eins og PET-CT, lungnavefsýni og ofmeðhöndlun vegna rangrar jákvæðrar greiningar á illkynja sjúkdómi.31 Eins og sést á mynd 6. Rannsóknin okkar benti á hóp umbrotsefna í sermi með hugsanlegt greiningargildi sem gæti bætt áhættulagskiptingu og síðari stjórnun á lungnahnútum sem greindust með CT.
Lungnahnúðar eru metnir með því að nota lágskammta tölvusneiðmynd (LDCT) með myndgreiningu sem benda til góðkynja eða illkynja orsök.Óviss útkoma hnúða getur leitt til tíðra eftirfylgniheimsókna, óþarfa inngripa og ofmeðferðar.Innifaling efnaskiptaflokkara í sermi með greiningargildi getur bætt áhættumat og síðari stjórnun á lungnahnútum.PET positron losun sneiðmyndataka.
Gögn úr bandarísku NLST rannsókninni og evrópsku NELSON rannsókninni benda til þess að skimun áhættuhópa með lágskammta tölvusneiðmynd (LDCT) geti dregið úr dánartíðni lungnakrabbameins1,3.Hins vegar er áhættumat og síðari klínísk stjórnun á miklum fjölda tilfallandi lungnahnúta sem greinast með LDCT enn erfiðast.Meginmarkmiðið er að hámarka rétta flokkun núverandi LDCT-undirstaða samskiptareglur með því að fella inn áreiðanleg lífmerki.
Ákveðin sameindalífmerki, eins og umbrotsefni í blóði, hafa verið auðkennd með því að bera saman lungnakrabbamein og heilbrigða samanburðarhópa15,17.Í núverandi rannsókn lögðum við áherslu á beitingu efnaskiptagreiningar í sermi til að greina á milli góðkynja og illkynja lungnahnúta sem greindust fyrir tilviljun með LDCT.Við bárum saman alþjóðlegt umbrotsefni í sermi heilbrigðrar stjórnunar (HC), góðkynja lungnahnúta (BN) og stigs I lungnakirtilkrabbameins (LA) sýni með UPLC-HRMS greiningu.Við komumst að því að HC og BN höfðu svipaðar efnaskiptasnið, en LA sýndi verulegar breytingar miðað við HC og BN.Við greindum tvö sett af umbrotsefnum í sermi sem aðgreina LA frá HC og BN.
Núverandi LDCT-undirstaða auðkenningarkerfi fyrir góðkynja og illkynja hnúða byggist aðallega á stærð, þéttleika, formgerð og vaxtarhraða hnúta með tímanum30.Fyrri rannsóknir hafa sýnt að stærð hnúða er nátengd líkum á lungnakrabbameini.Jafnvel hjá sjúklingum í áhættuhópi er hættan á illkynja sjúkdómum í hnútum <6 mm <1%.Hættan á illkynja hnútum sem mælast 6 til 20 mm er á bilinu 8% til 64%30.Þess vegna mælir Fleischner félagið með 6 mm þvermáli fyrir venjulegt tölvusneiðmyndaeftirlit.29 Hins vegar hefur áhættumat og meðferð óákveðinna lungnahnúta (IPN) stærri en 6 mm ekki verið framkvæmt með fullnægjandi hætti 31 .Núverandi stjórnun á meðfæddum hjartasjúkdómum byggist venjulega á vakandi bið með tíðum tölvusneiðmyndaeftirliti.
Á grundvelli fullgilts umbrots, sýndum við í fyrsta skipti skörun efnaskiptaeinkenna milli heilbrigðra einstaklinga og góðkynja hnúða <6 mm.Líffræðileg líkindi eru í samræmi við fyrri niðurstöður tölvusneiðmynda að hættan á illkynja hnútum <6 mm er jafn lítil og hjá einstaklingum án hnúta.30 Þess má geta að niðurstöður okkar sýna einnig að góðkynja hnútar <6 mm og ≥6 mm eru háir. líkt í efnaskiptaferlum, sem bendir til þess að virkniskilgreining á góðkynja orsök sé í samræmi óháð stærð hnúta.Þannig geta nútíma umbrotsefnistöflur fyrir greiningar í sermi veitt eina greiningu sem útilokunarpróf þegar hnúðar greinast í upphafi á CT og hugsanlega dregið úr raðeftirliti.Á sama tíma greindi sama spjaldið af efnaskiptalífmerkjum illkynja hnúta ≥6 mm að stærð frá góðkynja hnúðum og gaf nákvæmar spár um IPN af svipaðri stærð og óljós formfræðileg einkenni á CT myndum.Þessi efnaskiptaflokkari í sermi gekk vel við að spá fyrir um illkynja hnúta ≥6 mm með AUC 0,927.Samanlagt benda niðurstöður okkar til þess að einstök efnaskiptamerki í sermi geti sérstaklega endurspeglað snemmbúnar efnaskiptabreytingar af völdum æxla og haft hugsanlegt gildi sem áhættuspár, óháð stærð hnúta.
Sérstaklega eru lungnakirtilkrabbamein (LUAD) og flöguþekjukrabbamein (LUSC) helstu tegundir lungnakrabbameins sem ekki er smáfrumukrabbamein (NSCLC).Í ljósi þess að LUSC er sterklega tengt tóbaksnotkun47 og LUAD er algengasta vefjafræði tilfallandi lungnahnúta sem greindust við tölvusneiðmyndaskoðun48, var flokkunarlíkanið okkar sérstaklega byggt fyrir stig I kirtilkrabbameinssýni.Wang og félagar einbeittu sér einnig að LUAD og auðkenndu níu lípíðundirskriftir með því að nota fitulyf til að greina lungnakrabbamein á frumstigi frá heilbrigðum einstaklingum17.Við prófuðum núverandi flokkunarlíkan á 16 tilfellum af stigi I LUSC og 74 góðkynja hnúðum og sáum litla LUSC spánákvæmni (AUC 0,776), sem bendir til þess að LUAD og LUSC gætu haft sín eigin efnaskiptaeinkenni.Reyndar hefur verið sýnt fram á að LUAD og LUSC eru mismunandi hvað varðar orsök, líffræðilegan uppruna og erfðafræðilegar frávik49.Þess vegna ættu aðrar tegundir vefjafræði að vera með í þjálfunarlíkönum fyrir þýðisuppgötvun lungnakrabbameins í skimunaráætlunum.
Hér auðkenndum við sex oftast breyttar leiðir í kirtilkrabbameini í lungum samanborið við heilbrigða viðmiðunarhópa og góðkynja hnúða.Xantín og hypoxantín eru algeng umbrotsefni púrínefnaskiptaferilsins.Í samræmi við niðurstöður okkar voru milliefni sem tengdust púrínumbrotum marktækt aukning í sermi eða vefjum sjúklinga með kirtilkrabbamein í lungum samanborið við heilbrigða viðmiðunarhópa eða sjúklinga á innrásarstigi15,50.Hækkuð magn xantíns og hypoxantíns í sermi getur endurspeglað það vefaukandi áhrif sem krabbameinsfrumur þurfa að fjölga sér hratt.Vanstjórnun á efnaskiptum glúkósa er vel þekkt einkenni umbrota krabbameins51.Hér sáum við marktæka aukningu á pýrúvati og laktati í LA hópnum samanborið við HC og BN hópinn, sem er í samræmi við fyrri skýrslur um óeðlilegar blóðsykursleiðir í sermi umbrotssniði hjá sjúklingum sem ekki eru af smáfrumukrabbameini í lungum (NSCLC) og heilbrigt eftirlit.niðurstöðurnar eru í samræmi52,53.
Mikilvægt er að við sáum öfuga fylgni milli efnaskipta pýruvats og tryptófans í sermi kirtilkrabbameins í lungum.Sermismagn tryptófans var lækkað í LA hópnum samanborið við HC eða BN hópinn.Athyglisvert er að fyrri umfangsmikil rannsókn þar sem notuð var tilvonandi hópur leiddi í ljós að lágt magn tryptófans í blóðrás tengdist aukinni hættu á lungnakrabbameini 54 .Tryptófan er nauðsynleg amínósýra sem við fáum eingöngu úr mat.Við komumst að þeirri niðurstöðu að skerðing á tryptófani í sermi í kirtilkrabbameini í lungum gæti endurspeglað hraða eyðingu þessa umbrotsefnis.Það er vel þekkt að lokaafurð tryptófans niðurbrots í gegnum kynurenine ferlið er uppspretta de novo NAD+ nýmyndunar.Vegna þess að NAD+ er fyrst og fremst framleitt í gegnum björgunarferlið, á eftir að ákvarða mikilvægi NAD+ í umbrotum tryptófans í heilsu og sjúkdómum46.Greining okkar á TCGA gagnagrunninum sýndi að tjáning tryptófan flutningsefnis flutningsefnisins 7A5 (SLC7A5) var marktækt aukin í kirtilkrabbameini í lungum samanborið við eðlilega viðmiðunarhóp og var jákvæð fylgni við tjáningu glýkólýtíska ensímsins GAPDH.Fyrri rannsóknir hafa aðallega beinst að hlutverki niðurbrots tryptófans við að bæla ónæmissvörun gegn æxli40,41,42.Hér sýnum við fram á að hömlun á tryptófansupptöku með því að lækka SLC7A5 í lungnakrabbameinsfrumum leiðir til lækkunar á NAD-gildum frumna og samhliða deyfingu á glýkólýsandi virkni.Í stuttu máli gefur rannsókn okkar líffræðilegan grunn fyrir breytingar á efnaskiptum í sermi sem tengjast illkynja umbreytingu á kirtilkrabbameini í lungum.
EGFR stökkbreytingar eru algengustu stýristökkbreytingarnar hjá sjúklingum með NSCLC.Í rannsókn okkar komumst við að því að sjúklingar með EGFR stökkbreytingu (n = 41) höfðu heildar efnaskiptasnið svipað og sjúklingar með villigerð EGFR (n = 31), þó við fundum minnkað sermisþéttni sumra EGFR stökkbreyttra sjúklinga hjá acýlkarnitínsjúklingum.Hið staðfesta hlutverk asýlkarnitína er að flytja asýlhópa frá umfrymi inn í hvatbera fylkið, sem leiðir til oxunar fitusýra til að framleiða orku 55 .Í samræmi við niðurstöður okkar, greindi nýleg rannsókn einnig svipuð umbrotssnið milli EGFR stökkbreyttra og EGFR villigerða æxla með því að greina alþjóðlegt umbrot 102 kirtilkrabbameinsvefjasýna í lungum50.Athyglisvert er að acýlkarnitín innihald fannst einnig í EGFR stökkbreyttum hópnum.Þess vegna, hvort breytingar á acýlkarnitíngildum endurspegli EGFR-framkallaðar efnaskiptabreytingar og undirliggjandi sameindaferla gæti þess vegna þurft frekari rannsókn.
Að lokum, rannsókn okkar kemur á fót efnaskiptaflokkara í sermi fyrir mismunagreiningu á lungnahnútum og leggur til vinnuflæði sem getur hámarkað áhættumat og auðveldað klíníska stjórnun byggt á tölvusneiðmyndaskimun.
Þessi rannsókn var samþykkt af siðanefnd Sun Yat-sen háskólakrabbameinssjúkrahússins, fyrsta tengda sjúkrahúsinu við Sun Yat-sen háskólann og siðanefnd Zhengzhou háskólakrabbameinssjúkrahússins.Í uppgötvunar- og innri löggildingarhópunum var 174 serum frá heilbrigðum einstaklingum og 244 serum úr góðkynja hnúðum safnað frá einstaklingum sem gangast undir árlega læknisskoðun hjá krabbameinseftirlits- og forvarnardeild, Sun Yat-sen háskólans krabbameinsmiðstöð og 166 góðkynja hnúta.sermi.Stig I lungnakirtilkrabbameini var safnað frá krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans.Í ytri staðfestingarhópnum voru 48 tilfelli af góðkynja hnútum, 39 tilfelli af stigi I lungnakirtilkrabbameini frá First Affiliated Hospital Sun Yat-sen háskólans og 24 tilfelli af stigi I lungnakirtilkrabbameini frá Zhengzhou Cancer Hospital.Krabbameinsmiðstöð Sun Yat-sen háskólans safnaði einnig 16 tilfellum af lungnakrabbameini í flöguþekju I á stigi I til að prófa greiningarhæfni hins þekkta efnaskiptaflokkara (eiginleika sjúklinga eru sýnd í viðbótartöflu 5).Sýnum úr uppgötvunarhópnum og innri löggildingarárgangi var safnað á milli janúar 2018 og maí 2020. Sýnum fyrir ytri löggildingarárganginn var safnað á milli ágúst 2021 og október 2022. Til að lágmarka kynjaskekkju var um það bil jafnmörgum tilfellum karla og kvenna úthlutað til hvers kyns. árgangi.Uppgötvunarteymi og innra endurskoðunarteymi.Kyn þátttakenda var ákvarðað út frá sjálfsskýrslu.Upplýst samþykki var fengið frá öllum þátttakendum og engar bætur veittar.Einstaklingar með góðkynja hnúða voru þeir sem voru með stöðuga tölvusneiðmyndaskorun eftir 2 til 5 ár við greiningu, nema 1 tilfelli úr ytra staðfestingarsýninu, sem var safnað fyrir aðgerð og greind með vefjameinafræði.Að undanskildum langvinnri berkjubólgu.Tilfellum af kirtilkrabbameini í lungum var safnað fyrir lungnabrottnám og staðfest með meinafræðilegri greiningu.Fastandi blóðsýnum var safnað í sermisskiljunarglös án blóðþynningarlyfja.Blóðsýni voru storknuð í 1 klukkustund við stofuhita og síðan skilin í skilvindu við 2851 × g í 10 mínútur við 4°C til að safna floti í sermi.Sermi skammtar voru frystir við -80°C þar til umbrotsefnisútdráttur var dreginn út.Krabbameinsvarnadeild og læknisskoðun krabbameinsmiðstöðvar Sun Yat-sen háskólans safnaði sermi úr 100 heilbrigðum gjöfum, þar á meðal jafnmarga karla og kvenna á aldrinum 40 til 55 ára.Jafnt rúmmál af hverju gjafasýni var blandað, safninu sem myndast var skipt út og geymt við -80°C.Sermisblandan var notuð sem viðmiðunarefni fyrir gæðaeftirlit og gagnastöðlun.
Viðmiðunarsermi og prófunarsýni voru þídd og umbrotsefni voru dregin út með samsettri útdráttaraðferð (MTBE/metanól/vatn) 56 .Í stuttu máli var 50 μl af sermi blandað saman við 225 μl af ísköldu metanóli og 750 μl af ísköldu metýl tert-bútýleter (MTBE).Hrærið blönduna og ræktið á ís í 1 klukkustund.Sýnunum var síðan blandað saman og hvirfilblönduð með 188 μl af MS-gráðu vatni sem innihélt innri staðla (13C-laktat, 13C3-pýruvat, 13C-metíónín og 13C6-ísóleucín, keypt frá Cambridge Isotope Laboratories).Blandan var síðan skilin í skilvindu við 15.000 × g í 10 mínútur við 4 °C og neðri fasinn fluttur í tvö glös (125 μL hvert) fyrir LC-MS greiningu í jákvæðum og neikvæðum ham.Að lokum var sýnið látið gufa upp þar til það þornaði í háhraða lofttæmi.
Þurrkuðu umbrotsefnin voru leyst upp í 120 μl af 80% asetónítríli, hrærð í 5 mínútur og skilin í skilvindu við 15.000 × g í 10 mínútur við 4°C.Fljótandi vökvar voru fluttir yfir í gulbrúnt hettuglös úr gleri með örinnskotum til efnaskiptarannsókna.Ómarkviss efnaskiptagreining á ofurafkastamikilli vökvaskiljun-háupplausnarmassagreiningu (UPLC-HRMS) vettvang.Umbrotsefni voru aðskilin með Dionex Ultimate 3000 UPLC kerfi og ACQUITY BEH Amide súlu (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Í jákvæðri jónaham voru hreyfanlegu fasarnir 95% (A) og 50% asetónítríl (B), hver innihélt 10 mmól/L ammóníumasetat og 0,1% maurasýru.Í neikvæðri stillingu innihéldu hreyfanlegur fasar A og B 95% og 50% asetónítríl, í sömu röð, báðir fasarnir innihéldu 10 mmól/L ammóníumasetat, pH = 9. Gradient program var sem hér segir: 0-0,5 mín, 2% B;0,5–12 mín., 2–50% B;12–14 mín., 50–98% B;14–16 mín., 98% B;16–16.1.mín., 98 –2% B;16,1–20 mín, 2% B. Súlan var haldið við 40°C og sýnið við 10°C í sjálfvirka sýnatökutækinu.Rennsli var 0,3 ml/mín., inndælingarrúmmál 3 μl.Q-Exactive Orbitrap massarófsmælir (Thermo Fisher Scientific) með rafúðajónunargjafa (ESI) var notaður í fullri skönnun og ásamt ddMS2 vöktunarham til að safna miklu magni af gögnum.MS breytur voru stilltar sem hér segir: úðaspenna +3,8 kV/- 3,2 kV, háræðahiti 320°C, hlífðargas 40 arb, hjálpargas 10 arb, hitastig skyndihitara 350°C, skannasvið 70–1050 m/klst. upplausn.70 000. Gögn voru aflað með Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Til að meta gæði gagna voru sameinuð gæðaeftirlitssýni (QC) mynduð með því að fjarlægja 10 μL skammta af flotinu úr hverju sýni.Sex gæðaeftirlitssýnissprautur voru greindar í upphafi greiningarröðarinnar til að meta stöðugleika UPLC-MS kerfisins.Gæðaeftirlitssýni eru síðan sett reglulega inn í lotuna.Allar 11 lotur af sermissýnum í þessari rannsókn voru greindar með LC-MS.Skammtar af sermisblöndu úr 100 heilbrigðum gjöfum voru notaðir sem viðmiðunarefni í viðkomandi lotum til að fylgjast með útdráttarferlinu og aðlaga fyrir lotu-til-lotu áhrifum.Ómarkviss efnaskiptagreining á uppgötvunarhópnum, innri löggildingarhópnum og ytri löggildingarhópnum var framkvæmd við Metabolomics Center Sun Yat-sen háskólans.Ytri rannsóknarstofa tæknigreiningar- og prófunarmiðstöðvar tækniháskólans í Guangdong greindi einnig 40 sýni úr ytri hópnum til að prófa frammistöðu flokkunarlíkans.
Eftir útdrátt og blöndun var alger magngreining umbrotsefna í sermi mæld með vökvaskiljun með ofurafkastamiklu vökvaskiljun-tandem massagreiningu (Agilent 6495 triple quadrupole) með rafúðajónunargjafa (ESI) í margfeldisviðbragðseftirliti (MRM).ACQUITY BEH Amide súla (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) var notuð til að aðgreina umbrotsefni.Hreyfanlegur fasi samanstóð af 90% (A) og 5% asetónítríl (B) með 10 mmól/L ammóníum asetati og 0,1% ammoníak lausn.Stigullunarprógrammið var sem hér segir: 0–1,5 mín, 0% B;1,5–6,5 mín., 0–15% B;6,5–8 mín., 15% B;8–8,5 mín., 15%–0% B;8,5–11,5 mín., 0%B.Súlunni var haldið við 40 °C og sýninu við 10 °C í sjálfvirka sýnatökutækinu.Rennslishraði var 0,3 mL/mín og inndælingarrúmmál 1 μL.MS-breytur voru stilltar sem hér segir: háræðaspenna ±3,5 kV, úðaþrýstingur 35 psi, slíðurgasflæði 12 l/mín, slíðurgashiti 350°C, þurrkunargashiti 250°C og þurrkunargasflæði 14 l/mín.MRM umbreytingar tryptófans, pýruvats, laktats, hypoxanthins og xanthins voru 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 og 151,0–107.9 í sömu röð.Gögnum var safnað með Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Fyrir sermissýni voru tryptófan, pýrúvat, laktat, hypoxantín og xantín magngreind með því að nota kvörðunarferla staðlaðra blöndulausna.Fyrir frumusýni var tryptófaninnihald staðlað í samræmi við innri staðal og frumupróteinmassa.
Hámarksútdráttur (m/z og varðveislutími (RT)) var framkvæmdur með því að nota Compound Discovery 3.1 og TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Til að útiloka hugsanlegan mun á milli lota var hverjum einkennandi toppi prófunarsýnisins deilt með einkennandi toppi viðmiðunarefnisins úr sömu lotu til að fá hlutfallslegt magn.Hlutfallsleg staðalfrávik innri staðla fyrir og eftir stöðlun eru sýnd í viðbótartöflu 6. Mismunur á milli hópanna tveggja einkenndist af fölsku uppgötvunartíðni (FDR<0,05, Wilcoxon signed rank test) og fold change (>1,2 eða <0,83).Hrá MS gögn um útdregna eiginleika og tilvísunarsermi leiðrétt MS gögn eru sýnd í viðbótargögnum 1 og viðbótargögnum 2, í sömu röð.Hámarksskýring var framkvæmd út frá fjórum skilgreindum stigum auðkenningar, þar á meðal auðkennd umbrotsefni, hugsanlega merkt efnasambönd, meint einkenni efnasambandaflokka og óþekkt efnasambönd 22 .Byggt á gagnagrunnsleit í Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), voru líffræðileg efnasambönd með MS/MS samsvörun fullgilta staðla eða nákvæma samsvörun í mzCloud (stig > 85) eða Chemspider loksins valin sem milliefni á milli mismunaefnaskipta.Hámarksskýringar fyrir hvern eiginleika eru innifalin í viðbótargögnum 3. MetaboAnalyst 5.0 var notað til einþáttagreiningar á magni umbrotsefna sem er staðlað saman.MetaboAnalyst 5.0 lagði einnig mat á auðgunargreiningu á KEGG ferli út frá marktækt mismunandi umbrotsefnum.Aðalþáttagreining (PCA) og aðgreiningargreining að hluta (PLS-DA) voru greindar með því að nota ropls hugbúnaðarpakkann (v.1.26.4) með staðlaðri stafla og sjálfsstærð.Ákjósanlegasta lífmerkjalíkanið fyrir umbrotsefni til að spá fyrir um illkynja hnúta var búið til með því að nota tvöfalda flutningsaðhvarf með minnst algerri rýrnun og vali (LASSO, R pakki v.4.1-3).Frammistaða mismununarlíkans í greiningar- og fullgildingarsettum einkenndist af því að meta AUC byggt á ROC greiningu í samræmi við pROC pakkann (v.1.18.0.).Besta líkindaskerðingin var fengin út frá hámarks Youden vísitölu líkansins (næmi + sértækni - 1).Sýni með gildi sem eru lægri eða hærri en viðmiðunarmörkin verða spáð sem góðkynja hnúða og lungnakirtilkrabbamein, í sömu röð.
A549 frumur (#CCL-185, American Type Culture Collection) voru ræktaðar í F-12K miðli sem innihélt 10% FBS.Stuttar hárnála RNA (shRNA) raðir sem miða á SLC7A5 og nontargeting control (NC) voru settar inn í lentiveiruferjuna pLKO.1-puro.Andskynjaraðir shSLC7A5 eru sem hér segir: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Mótefni gegn SLC7A5 (#5347) og túbúlíni (#2148) voru keypt frá Cell Signaling Technology.Mótefni gegn SLC7A5 og túbúlíni voru notuð í þynningu 1:1000 fyrir Western blot greiningu.
Seahorse XF sykursýkisstreituprófið mælir utanfrumusýrustig (ECAR).Í prófuninni voru glúkósa, oligomýcín A og 2-DG gefin í röð til að prófa glýkólýsandi getu frumna eins og mælt er með ECAR.
A549 frumur transsýktar með non-targeting control (NC) og shSLC7A5 (Sh1, Sh2) voru húðaðar yfir nótt í 10 cm þvermál diska.Umbrotsefni frumna voru dregin út með 1 ml af ísköldu 80% vatnskenndu metanóli.Frumur í metanóllausninni voru skafnar af, safnað í nýtt rör og skilið í skilvindu við 15.000 × g í 15 mínútur við 4°C.Safnið 800 µl af floti og þurrkið með háhraða lofttæmi.Þurrkuðu umbrotsefniskornin voru síðan greind með tilliti til tryptófansmagns með því að nota LC-MS/MS eins og lýst er hér að ofan.NAD(H) magn frumna í A549 frumum (NC og shSLC7A5) var mælt með því að nota magnbundið NAD+/NADH litmælingasett (#K337, BioVision) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.Próteinmagn var mælt fyrir hvert sýni til að staðla magn umbrotsefna.
Engar tölfræðilegar aðferðir voru notaðar til að ákvarða magn úrtaks til bráðabirgða.Fyrri efnaskiptarannsóknir sem miða að uppgötvun lífmerkja15,18 hafa verið taldar viðmið fyrir stærðarákvörðun og miðað við þessar skýrslur var úrtakið okkar fullnægjandi.Engin sýni voru útilokuð úr rannsóknarhópnum.Sermissýnum var úthlutað af handahófi í uppgötvunarhóp (306 tilvik, 74,6%) og innri löggildingarhóp (104 tilvik, 25,4%) fyrir ómarkvissar rannsóknir á efnaskiptafræði.Við völdum einnig af handahófi 70 tilvik úr hverjum hópi úr uppgötvunarsettinu fyrir markvissar rannsóknir á efnaskiptafræði.Rannsakendur voru blindaðir fyrir hópúthlutun meðan á LC-MS gagnasöfnun og greiningu stóð.Tölfræðilegar greiningar á efnaskiptagögnum og frumutilraunum er lýst í viðkomandi köflum Niðurstöður, Myndsögur og Aðferðir.Magngreining á frumu tryptófani, NADT og glýkólýsandi virkni var framkvæmd þrisvar sinnum sjálfstætt með sömu niðurstöðum.
Fyrir frekari upplýsingar um hönnun rannsóknarinnar, sjá Natural Portfolio Report Abstract sem tengist þessari grein.
Hrá MS gögn um útdregna eiginleikana og staðlað MS gögn viðmiðunarsermisins eru sýnd í viðbótargögnum 1 og viðbótargögnum 2, í sömu röð.Hámarksskýringar fyrir mismunandi eiginleika eru kynntar í viðbótargögnum 3. Hægt er að hlaða niður LUAD TCGA gagnapakkanum frá https://portal.gdc.cancer.gov/.Inntaksgögnin til að teikna línuritið eru veitt í upprunagögnunum.Upprunagögn eru veitt fyrir þessa grein.
National Lung Screening Study Group o.fl. Að draga úr lungnakrabbameinsdauða með lágskammta tölvusneiðmynd.Norður-Englandi.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR og Prophet, PC Lungnakrabbameinsskimun með því að nota lágskammta helical CT: niðurstöður úr National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Skjár 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, o.fl.Draga úr lungnakrabbameinsdauða með rúmmáls CT skimun í slembiraðaðri rannsókn.Norður-Englandi.J. Med.382, 503–513 (2020).
Birtingartími: 18. september 2023