CRISPR (e. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) er þriðju kynslóðar erfðabreytingartækni sem hefur gjörbylta heiminum með miklum afköstum. Hún hefur verið notuð til að meðhöndla ýmsa líffræðilega sjúkdóma og sýkingar. Ýmsar bakteríur og aðrar dreifkjörnungar (eins og fornbakteríur) hafa einnig CRISPR/Cas9 kerfi til að verjast fögum. Greint hefur verið frá því að CRISPR/Cas9-byggðar aðferðir geti hamlað vexti og framgangi þrefalt neikvæðs brjóstakrabbameins (TNBC) með því að miða á hugsanlega breytt ónæmisgen, umritun og erfðafræðilega stjórnun. Þessar meðferðaraðgerðir geta hjálpað til við að takast á við krefjandi vandamál eins og lyfjaónæmi sem sést jafnvel í TNBC. Eins og er eru ýmsar aðferðir notaðar til að afhenda CRISPR/Cas9 til markfrumna, svo sem líkamlegar (örinnspýting, rafgötun og vatnsaflfræðilegar aðferðir), veiru- (adeno-tengd veira og lentiveirur) og ekki-veiru (lípósóm og lípíðnanóagnir). Þó að ýmsar gerðir hafi verið þróaðar til að rannsaka sameindafræðilegar orsakir TNBC, þá takmarkar skortur á næmum og markvissum aðferðum til að beita erfðabreytingartólum in vivo klíníska notkun þeirra. Í stuttu máli skoðar þessi yfirlitsgrein ítarlega framfarir, áskoranir, takmarkanir og horfur CRISPR/Cas9 meðferðar við TNBC byggt á fyrirliggjandi gögnum. Við leggjum einnig áherslu á hvernig samsetning gervigreindar og vélanáms getur bætt CRISPR/Cas9 aðferðir við meðferð TNBC.
Krabbamein einkennist af stjórnlausri frumuskiptingu, röskun á frumuhringrásarstöðvum og stökkbreytingum í æxlisbælandi genum (TSGs) (Matthews o.fl., 2022). Meðal mismunandi tegunda krabbameins er brjóstakrabbamein algengasta tegund krabbameins hjá konum og hefur háa dánartíðni um allan heim (Waks og Winer, 2019). Brjóstakrabbamein er ólíkur sjúkdómur með fjölbreytt einkenni, svo sem vefjafræðilega og líffræðilega eiginleika, klínísk einkenni og hegðun og svörun við meðferð (Weigelt o.fl., 2010). Flokkun brjóstakrabbameins veitir nákvæma innsýn í greiningu brjóstakrabbameins og horfur æxlis. Notkun sameiginlegra lífmerkja og klínískra meinafræðilegra einkenna hefur verið aðalviðmiðið fyrir flokkun brjóstakrabbameins (Tsang og Tse, 2019). Horfur og svörun við meðferð brjóstakrabbameins eru undir áhrifum fjölmargra þátta, þar á meðal nærveru estrógenviðtaka (ER), prógesterónviðtaka (PR), vaxtarþáttarviðtaka 2 fyrir húðþekju manna (HER2/neu) og vefjafræðilegt stig, tegund æxlis og stig. stærð og eitlamyndun (Al-Tubaiti, 2020). Fimm innri sameindagerðir brjóstakrabbameins hafa verið greindar, þar á meðal luminal A, luminal B, HER2-auðgað, basal-líkt og claudin-lágt (Prat o.fl., 2015). TNBC er sameindagerð krabbameins sem tjáir ekki öll ER, PR og HER2 (Yin o.fl., 2020). Þessir sjúklegu eiginleikar tengjast TNBC, sem staðfestir hraða framgang þess og árásargjarnari eðli en nokkur önnur tegund brjóstakrabbameins (Feng o.fl., 2018). Að auki notuðu Peru o.fl. (2000) örflögutækni til að endurflokka brjóstakrabbamein og bera kennsl á fimm innri undirgerðir brjóstakrabbameins (Cadenas, 2012). Basal-líkt brjóstakrabbamein er undirgerð brjóstakrabbameins sem hefur þrefalt neikvæða svipgerð og tengist hraðri framgangi. Það skal tekið fram að öll brjóstakrabbamein sem líkjast grunnfrumukrabbameini eru oft ranglega greind sem TNBC, en aðeins 77% eru TNBC; Aftur á móti eru 71–91% af TNBC grunnfrumukrabbameini, sem bendir til þess að þessar tvær gerðir brjóstakrabbameins skarast og séu flokkaðar á mismunandi hátt (Wang D.-Y. o.fl., 2019). Þetta skapar þörf á að greina fjölbreytileika TNBC til að skýra horfur og bera kennsl á hugsanleg svörun við núverandi og framtíðarmeðferðum. Að auki eru TNBC 15–20% allra brjóstakrabbameinstilfella og eru algengari hjá konum yngri en 50 ára. Stökkbreytingar í BRCA1 eða BRCA2 hafa verið tilkynntar í um það bil 20% af TNBC tilfellum (Xie o.fl., 2017; Tzikas o.fl., 2017, 2020). Rannsóknir hafa einnig sýnt að TNBC hefur sérstakt ónæmisörumhverfi sem inniheldur mikið magn af æðaþelsvaxtarþáttum, æxlistengdum átfrumum (TAM), æxlisíferandi eitilfrumum (TIL) og öðrum sameindum sem taka þátt í æxlisvexti og flutningi. Því er skilningur á örumhverfi TNBC mikilvægur fyrir horfur og meðferð (Fan og He, 2022).
Til að meta horfur vegna TNBC og tryggja árangursríka meðferð er nákvæm greining, aðallega byggð á ónæmisvefjafræðilegri aðferð (IHC) til að greina ER, PR og HER2, og brjóstamyndatöku til að greina æxli í brjóstum, mikilvæg. Hins vegar getur brjóstamyndataka ekki sýnt nægilega vel einkenni innan æxlis eins og drepsmyndun og bandvefsmyndun (Deepak Singh o.fl., 2021). Þar sem slæmar horfur og greiningar koma í veg fyrir að læknar geti ávísað réttum lyfjum (Chaudhary, 2020), eru ýmsar aðferðir notaðar til að bæta umönnun sjúklinga með TNBC. Eins og er eru tvö lyf, doxorubicin og cyclophosphamide, notuð hjá sjúklingum með TNBC og hafa sýnt góðan árangur. Að auki eru önnur platínulyf notuð, svo sem karbóplatín og cisplatín (Sikov o.fl., 2015). Að auki hafa PARP-hemlar eins og Olaparib, Velaparib og PF-01367338 verið notaðir sem hugsanleg krabbameinslyf til meðferðar við TNBC (Ishino o.fl., 2018). Þar sem greint hefur verið frá því að Wnt/b-Catenin, NOTCH og Hedgehog boðleiðir gegni hlutverki í tilurð og framgangi TNBC, gæti það verið mikilvæg stefna að beina lyfjum að þessum ferlum (Aysola o.fl., 2013). Þó að skurðaðgerðir, geislameðferð og krabbameinslyfjameðferð séu enn meginstoð meðferðar við TNBC í dag, hafa orðið miklar framfarir í þróun nýrra meðferða, þar á meðal markvissrar meðferðar, ónæmismeðferðar, ýmissa CRISPR-tengdra genabreytingartækja eins og Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing og CRISPR/Cas9-markvissrar genameðferðar. Hér munum við einbeita okkur að ýmsum CRISPR-tengdum genabreytingartólum sem notuð eru við meðferð TNBC. Meðal þeirra hefur CRISPR/Cas9 vakið mikla athygli.
Cas9n, einnig þekkt sem Cas9 nikkasi, er erfðabreytt afbrigði af Cas9 próteininu sem er unnið úr CRISPR/Cas9 erfðabreytingarkerfinu (Gupta o.fl., 2019). Í upprunalegri mynd inniheldur Cas9 próteinið tvö núkleasa-lén: RuvC og HNH, en aðalhlutverk þeirra er að kljúfa báða DNA-þræðina. Hins vegar, í Cas9n, er annað núkleasa-lénið, HNH, erfðabreyttan og verður óvirkt. Þess vegna er HNH-lénið í Cas9n óvirkt. Aðeins RuvC-lénið er virkt, sem gerir Cas9n kleift að klippa eða búa til brot á einstökum DNA-þráðum (Trevino og Zhang, 2014). Í samanburði við Cas9 getur Cas9n dregið úr áhrifum utan markhóps á áhrifaríkan hátt og bætt viðgerðarferli frumna nákvæmlega. Cas9n er hægt að nota til að leysa ýmis vandamál, svo sem að búa til brot á ákveðnum stöðum í tvíþátta DNA. Í þessu skyni voru tvær Cas9n sameindir sameinaðar og notaðar saman (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) er mítógen-virkjaður prótein kínasi sem gegnir hlutverki lykilstjórnanda við meinvarp í TNBC (Cronan o.fl., 2012).
MLK3 getur virkjað margar boðleiðir sem leiða til meinvarpa í frumulengdarfrumukrabbameini (TNBC). Til dæmis stjórnar c-Jun N-enda kínasa (JNK) ferillinn frumuhreyfanleika og niðurbroti utanfrumuefnis, og MLK3 virkjar JNK ferilinn, sem eykur þannig frumuhreyfanleika og veitir ífarandi eiginleika (Rattanasinchai og Gallo, 2016). MLK3 stjórnar einnig EMT. Til að gera þetta virkjar það niðurstreymis umritunarþætti eins og Snail, Slug og Twist. Þessir þættir hamla tjáningu þekjuvefsmerkja og stuðla að tjáningu mesenchymal merkja, sem leiðir til þess að meinvarpað svipgerð myndast (Casalino o.fl., 2023). MLK3 hefur reynst gegna hlutverki í endurgerð ECM og virkjun próteasa eins og matrix metalloproteinasa (MMPs) sem brjóta niður ECM. Þetta auðveldar innrás æxlisfrumna og útbreiðslu þeirra til fjarlægra staða (Katari o.fl., 2019). Þannig hafa fyrri rannsóknir sýnt að MLK3 gegnir mikilvægu hlutverki í TNBC. Rattanasinchai og Gallo notuðu TNBC líkön til að rannsaka hlutverk MLK3 og komust að því að það stuðlar að krabbameinsþróun í gegnum ákveðnar boðleiðir. Þeir notuðu CRISPR/Cas9n til að breyta MLK3 og sáu marktæka minnkun á TNBC meinvörpum (Rattanasinchai og Gallo, 2016).
dCas9, oft kallað óvirkt Cas9, er breytt afleiða Cas9 próteinsins. Ólíkt virka Cas9 skortir dCas9 endonucleasa virkni, sem gerir það ófært um að valda tvíþátta rofi í DNA. Þess vegna er hægt að nota dCas9 til að miða nákvæmlega á tiltekin svæði í erfðamenginu án þess að breytingar eða lagfæringar verði á DNA röðinni (Wang o.fl., 2016). Í dCas9 eru tvö endonucleasa prótein, RuvC og HNH, óvirk með því að bæla niður mikilvægar amínósýruleifar. (Richter o.fl., 2016). Þrátt fyrir skort á DNA klofnunarvirkni gegnir dCas9 fjölda mikilvægra hlutverka í erfðafræðilegum rannsóknum og líftækni. Til dæmis gerir það kleift að sjá tiltekin svæði í erfðamenginu, auðveldar umritunarstjórnun og stuðlar að erfðabreytingum (Brocken o.fl., 2018).
Umritunarþátturinn ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) gegnir sérstöku og mikilvægu hlutverki í að miðla umbreytingu þekjufrumna í mesenchymal frumur (EMT), frumuferli sem á sér stað við fósturþroska, vefjaviðgerðir og krabbameinsframvindu. Hann felur í sér umbreytingu þekjufrumna í mesenchymal frumur, sem leiðir til breytinga á frumugerð, hreyfanleika, innrásargetu o.s.frv. (Wu o.fl., 2020). ZEB1 hamlar mörgum þekjufrumumerkjum, svo sem E-cadherin og Occludin, sem bera ábyrgð á að viðhalda frumu-frumu viðloðun og pólun þekjufrumna í TNBC (Moreno-Bueno o.fl., 2008). Að auki virkjar ZEB1 ákveðin merki eins og N-cadherin, vimentin og fibronectin (Konradi o.fl., 2014) og stjórnar einnig genum sem taka þátt í endurgerð frumugrindar eins og Rho GTPasa og matrix metalloproteinasa (MMPs) (Huang). o.fl., 2014). 2022), auk þess hefur það einnig áhrif á ýmsar boðleiðir eins og umbreytandi vaxtarþátt-β (TGF-β), Wnt boðleiðir o.s.frv., og stuðlar þannig að æxlisinnrás og meinvarpi í TNBC (Chen o.fl., 2016). Fjölmargar rannsóknir og vísindalegar sannanir benda til þess að ZEB1 hafi mikla möguleika sem verðmætt efni til að greina og meðhöndla TNBC. Í nýlegri rannsókn notuðu Waryah o.fl. TNBC líkan og náðu fullkominni bælingu á ZEB1 með dCas9. Þannig komust þeir að mjög mikilli sértækni og næstum fullkominni hömlun á ZEB1 við in vivo aðstæður (Waryah o.fl., 2023).
CRISPR/Cas12 er genabreytingartæki sem kallast CRISPR/Cpf1. Það er dregið af CRISPR/Cas kerfinu, þar sem hugtakið Cas12 vísar til CRISPR-tengds próteins 12 (Bharathkumar o.fl., 2022), sem er alveg svipað Cas9. Eini munurinn er sá að það inniheldur Cas12 próteinið. Ólíkt Cas9 hefur Cas12 einstaka virkni, svo sem að mynda klístraða enda við genabreytingarferlið, en Cas9 myndar sljóa enda (Wang o.fl., 2021). Þessi eiginleiki Cas12 stuðlar að sértækri DNA-breytingartækni þess. Sem prótein sem getur nákvæmlega þekkt og klippt mark-DNA, hefur það einstaka fjölhæfni, sem gerir það að áhrifaríku tæki fyrir fjölbreytt notkunarsvið, þar á meðal genabreytingar (Pickar-Oliver og Gersbach, 2019).
Líkt og aðrar CRISPR afbrigði er CRISPR/Cas12 einnig fær um að slökkva á eða virkja gen í TNBC, sem miðar á gen sem gegna mikilvægu hlutverki í meingerð þess eða svörun við meðferð (Yang og Zhang, 2023). Til að ná þessu ferli var þróað leiðbeinandi RNA (gRNA) sem beinir Cas12 að markgeninu. Þegar Cas12 binst markinu sínu veldur það tvíþátta rofi í DNA og virkjar DNA viðgerðarferli. Í viðgerðarferlinu geta röng núkleótíð verið felld inn, sem leiðir til stökkbreytinga í genum og virknitaps (Zhang o.fl., 2021a). Að auki var einnig notuð endurbætt útgáfa af Cas12 ensíminu (kallað dCas12) til að virkja gen. Með því að sameina það við umritunarvirkja er hægt að örva ákveðin gen og þar með virkja þau. Þessi tækni hefur mikla möguleika til að stuðla að virkjun æxlisbælandi gena (Sultan o.fl., 2022).
Frumritun er nýþróuð og afar framúrskarandi erfðabreytingartækni. Hún er fær um að breyta DNA lífveru mjög nákvæmlega (Chen og Liu, 2023). Frumritun er náð með samþættingu tveggja meginþátta: breytts CRISPR/Cas9 ensíms og öfugs umritunar. Hlutverk CRISPR/Cas9 ensímsins er að miða sértækt á nákvæma staði í erfðamenginu, en öfug umritun hjálpar til við að breyta DNA rækilega á markstaðnum (Hassan o.fl., 2021). Í frumritunarferlinu felur fyrsta skrefið í sér að búa til leiðbeinandi RNA fyrir frumritun (pegRNA) (Standage-Beier o.fl., 2021). Það inniheldur markröðina og RNA sniðmátið sem samsvarar æskilegum breytingarstað í mark-DNA. PegRNA er síðan sett inn í markfrumurnar ásamt frumritunarknúkleasa (PE2). PE2 er samrunaprótein sem samanstendur af Cas9 ensími, öfugs umritunar og millistykki fyrir frumritun (Martín-Alonso o.fl., 2021). Inni í frumunni leita pegRNA og PE2 fléttur að því tiltekna DNA sem þau vilja breyta. Cas9 ensímið klippir DNA og býr til sniðmát sem samanstendur af einum þráðum (Choi o.fl., 2022). Öfug umritun notar þetta sniðmát til að undirbúa DNA-ið fyrir breytingu. Samhliða afritun DNA eru einnig leiðbeiningar um breytingu á RNA sniðmátinu innifaldar. Að lokum er nýstofnaði DNA þráðurinn notaður sem sniðmát til að gera við brotið í DNA-inu, sem leiðir til breyttrar DNA raðar sem inniheldur tilætlaða breytingu (Ochoa-Sanchez o.fl., 2021). Forritsbreytingaraðferðir geta leitt til útbreiddra stökkbreytinga í genum. Það getur miðað á punktstökkbreytingar, innsetningar, eyðingar og jafnvel genaskiptingar (Anzalone o.fl., 2019; Chen og Liu, 2023). Forritsbreyting býður upp á nokkra kosti umfram fyrri erfðabreytingartækni. Þar á meðal er aukin nákvæmni, minni áhrif utan markmiðs og möguleikinn á að breyta DNA án þess að reiða sig á tvíþráða DNA brot (Anzalone o.fl., 2020).
CRISPR/Cas9 tæknin var upphaflega þróuð til að vernda bakteríur gegn plasmíðflutningi og fagasýkingu og var síðar endurnýtt sem áhrifaríkt RNA-byggt DNA markviss verkfæri fyrir erfðabreytingar (Jiang og Doudna, 2017). Þar að auki hefur verið greint frá því að CRISPR/Cas9 kerfið sé til staðar í 50% og 87% af erfðamengjum baktería og fornbaktería, talið í sömu röð (Ishino o.fl., 2018). CRISPR/Cas9 er mögulegt verkfæri til að eyða, setja inn og leiðrétta hvaða óeðlilega erfðaröð sem er með því að nota in vivo og in vitro aðferðir (Sabit o.fl., 2021). Þar að auki hefur verið sýnt fram á að CRISPR/Cas9 er hluti af aðlögunarhæfa ónæmiskerfinu vegna sértækni þess fyrir markgen sem vekja áhuga (Chen og Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 samanstendur af Cas9 og einu leiðar-RNA (sgRNA). Cas9 er innkirnalí sem er samsett úr mörgum próteinþáttum. Þar að auki hefur Cas9 einstaka byggingar- og byggingareiginleika (Pacesa o.fl., 2022) þar sem það samanstendur af tveimur blöðum: greiningarblaði (REC) og núkleasa (NUC). REC-blaðið skiptist enn fremur í þrjú svæði: REC1, REC2 og brúarhelixa (Cromwell o.fl., 2018). NUC samanstendur af þremur blöðum, þ.e. RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH og víxlverkunarléni frumrýmis aðliggjandi mótífs (PAM) (Mynd 1) (Song o.fl., 2016). sgRNA samanstendur af tveimur þáttum, þar á meðal CRISPR RNA (crRNA) og umritunar-smá-RNA (spo-RNA) (Mynd 1). SgRNA tengir Cas9 próteinið við connexín til að mynda virkt fléttusamband, einnig þekkt sem effector flétta (Richter o.fl., 2012). crRNA er 18–20 núkleótíða basapar sem gegnir mikilvægu hlutverki í að bera kennsl á mark-DNA raðir. Að auki parast crRNA við mark-DNA og tracrRNA virkar sem uppbygging fyrir Cas9 núkleasann til að binda mark-DNA (Manghwar o.fl., 2019). Hins vegar hefur PAM röðin 3 núkleótíð, sem staðfestir, skilgreinir og miðlar bindingu effector fléttunnar við DNA. Cas9 prótein fléttueiningarnar RuvC og HNH hafa hvatavirkni (Richter o.fl., 2012; Asmamaw og Zawdie, 2021). HNH núkleasa lénið í Cas9 undireiningunni klýfur DNA þráðinn sem tengist crRNA. RuvC núkleasalénið klýfur aðra DNA-þræði og myndar tvíþátta rof (DSB), eftir það virkjast tvær mismunandi viðgerðaraðferðir fyrir DNA-rofi (Jiang og Doudna, 2017) (Mynd 1).
Mynd 1. Yfirlit yfir CRISPR/Cas9 (A). Þættir CRISPR/Cas9 kerfisins: (i). Cas9 endonucleasi ber ábyrgð á að klippa mark DNA röðina, (ii) eitt leiðar RNA (sg) sem myndast við samruna crRNA og tra-crRNA kímæra. (tveir). Cas9 inniheldur nokkra þætti eins og Rec I, Rec II, NUC blað (HNH og Ruv C eru undirþættir) og PAM víxlverkunarlén (C) með samsvarandi virkni. CRISPR/Cas9 próteinfléttan klýfur DNA raðir í óviðbótar og viðbótar form (D). CRISPR/Cas9 breytir erfðamenginu í þremur stigum: greiningu, klippingu og viðgerð. Hannaða sg-RNA leiðbeinir Cas9 og þekkir æskilega röð í gegnum viðbótarþáttinn crRNA. Cas9 þekkir PAM röðina við 5′-NGG-3′ og bræðir DNA, myndar DNA-RNA blending og virkjar klofning. HNH-lénið í Cas9 klýfur viðbótarþáttinn og RuvC-lénið klýfur óviðbótarþáttinn. CRISPR/Cas9 lagar tvíþátta DNA með því að brjóta það á tvo vegu: með ósamræmdri endatengingu (NHEJ) og samsvörunarstýrðri viðgerð (HDR). NHEJ lagar tvíþátta DNA í fjarveru framandi samsvörunar DNA í gegnum ensímferli, sem er villuhættur aðferð sem getur sett inn eða fjarlægt handahófskenndar DNA-raðir. HDR er mjög sértækt og krefst einsleitra DNA-sniðmáta.
Viðgerðarferlar sem CRISPR/Cas9 miðlar fela í sér bæði ósamræmanlegar endatengingar (NHEJ) og samræmanlegar viðgerðarferla (HDR). NHEJ er villuleið þar sem hún felur í sér innsetningu eða eyðingu og krefst ekki neins mynsturs meðan á viðgerðarferlinu stendur. Hún notar handahófskennd núkleótíð til að búa til stöðluð prótein (Abbasi o.fl., 2021). Þetta viðgerðarkerfi samanstendur af fjórum fléttum eins og KU fléttunni, krossbætandi próteinfléttu af gerð 4 (XRCC-4), DNA endavinnsluensíminu og próteinkínasa DNA-PKcs (Abbasi o.fl., 2021). KU-fléttupróteinið hefur tvær undireiningar, Ku 70 og Ku 80, og gegnir mikilvægu hlutverki í NHEJ-kerfinu, þar sem viðgerðarferlið hefst með bindingu tveggja undireininga (Ku 70 og Ku 80) við sljóa eða næstum sljóa enda mark-DNA (Abbasi o.fl., 2021), sem þjónar sem stuðningur til að laða aðra NHEJ-tengda þætti að meiðslustaðnum (Yang o.fl., 2020). XRCC-4 og DNA-lígasi eru samsett úr 334 og 911 amínósýrum, talið í sömu röð, og XRCC4-DNA-lígasi IV-fléttan örvar bindingu DNA-enda (Chatterjee o.fl., 2015). DNA-endavinnsluensím, einnig þekkt sem fjölkirnis kínasa 3′-fosfat, er DNA-endavinnsluensím. Það getur fjarlægt 3′P hópinn í DNA og fosfórýlerað 5′OH hópinn við DSB-viðgerð. Það felur einnig í sér viðgerð á einþátta rofum (SSBs) með því að nota SSB viðgerðarferilinn (Chatterjee o.fl., 2015). Prótein kínasi DNA-PKcs er DNA-háð prótein kínasi sem samanstendur af hvataðri undireiningu PIKKs (fosfatidýlinositól 3-kínasa-tengdra kínasa) og ataxia telangiectasia mutated (ATM) fjölskyldunnar, sem og ATM og Rad3-tengdum ATR, þráðrofum (DSBs) og einþátta rofi (Yue o.fl., 2020; Peng o.fl., 2016).
HDR er nákvæmari og hentugri viðgerðaraðferð þar sem upplýsingarnar eru afritaðar með því að nota óskemmda mynd af samsvarandi DNA tvíþátta, þó það krefjist nærveru systurkromatíða. Þetta gerist á S/G2 áfanga frumuhringrásar spendýra. HDR kemur aðallega fyrir í gerategundum, en NHEJ er mikilvægt í spendýrum (Burma o.fl., 2006; Abbasi o.fl., 2021). Heildarviðgerðaraðferðin er sýnd á mynd 1.
Þar sem TNBC orsakast af erfðafræðilegum og erfðafræðilegum frávikum, gæti leiðrétting á illkynja erfða-/erfðafræðilegum frávikum með CRISPR/Cas9 verið skynsamleg meðferðaraðferð (Chen o.fl., 2019). Þar að auki geta sumir umritunarþættir sem taka þátt í frumubundinni umritunarstjórnun sýnt einstaka eiginleika krabbameinsfrumna, sem bendir til þess að umritunarstjórnun geti verið frábær aðferð við krabbameinsmeðferð (Drost o.fl., 2017). Að nýta þessa sameindaeiginleika æxla, svo sem erfða-, erfðafræðilega og umritunargalla, til lyfjaþróunar getur bætt klínískar niðurstöður og dregið úr skimunarkostnaði. CRISPR er mögulegt erfðabreytingartæki sem getur ekki aðeins greint og borið kennsl á krabbameinsvaldandi erfðafræðileg markmið, heldur er einnig hægt að nota það til að breyta, bæla niður og erfðafræðilega breyta krabbameinsgenum í mannafrumum (Tafla 1) (Ahmed o.fl., 2021). Nokkrar CRISPR skimanir hafa verið gerðar til að leita að genum sem tengjast æxlisbælandi þáttum, krabbameinsgenum og lyfjaónæmi. Notkun CRISPR/Cas9 til að breyta ýmsum TNBC krabbameinsgenum er sýnd á mynd 2.
Mynd 2. Genbreyting á ýmsum krabbameinsgenum TNBC með CRISPR/Cas9 sem leiðir til minni æxlisvaxtar og meinvarpa. Þessi krabbameinsgen eru meðal annars CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 og CXCR7, Crypto1, ROR1 og ST8SIA, sem taka þátt í tilurð og meinvarpi TNBC.
Frumuflutningur, innrás og umbreyting þekjuvefs-mesenchymals (EMT) krabbameinsfrumna tengjast ITGA9. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að ITGA9 gegnir lykilhlutverki í Notch ferlinu og gegnir áhugaverðu hlutverki í meinvarpi í rákvöðvakrabbameini (Molist o.fl., 2020). Þar að auki kom í ljós að ITGA9 tengist náið horfum sjúklinga í nokkrum æxlisgerðum, þar á meðal brjóstakrabbameini (Wang Z. o.fl., 2019). Þar að auki sýndi lífupplýsingagreining á ITGA9 að tjáning þess í TNBC var marktækt hærri en í öðrum undirgerðum brjóstakrabbameins. Hækkað ITGA9 gildi tengjast meinvarpi og bakslagi æxlis hjá sjúklingum með TNBC. Útsláttur ITGA9 með CRISPR/Cas9 leiddi til eiginleika sem líkjast krabbameinsstofnfrumum (CSC), æðamyndunar æxlis, æxlisvaxtar og minni meinvarpa með því að stuðla að niðurbroti β-catenin í TNBC (Wang Z. o.fl., 2019).
Crypto-1 tilheyrir TGF-β fjölskyldunni og er mikilvægt fyrir fósturvísismyndun snemma, viðhald stofnfrumna og meinvarp krabbameins (Ishii o.fl., 2021). Það er einnig þekkt sem Tdgf-1 og er krabbameinsvaldandi GPI-fest merkjasendingaprótein sem tekur þátt í stjórnun á myndun frumrákar, miðlags og innæðar, sem og stofnun vinstri/hægri ósamhverfu í þroska líffæra meðan á fósturvísismyndun stendur (Zhang o.fl., 2021b). Að auki hefur verið sýnt fram á að Cripto-1 tekur þátt í þekjuvefs-miðlagsbreytingum (EMT) sem stofnfrumumerki (Zhang o.fl., 2021b). EMT er mikilvægt ekki aðeins fyrir ýmis ferli eins og fósturvísisþroska, bandvefsmyndun og sárgræðslu, heldur einnig fyrir krabbameinsinnrás og meinvarp. Að auki hefur verið sýnt fram á að Cripto-1 hefur samskipti við fjóra Notch viðtaka og eykur þroska þeirra eftir þýðingu (Brandstadter og Maillard, 2019). Notch boðleiðin er þekkt fyrir að taka þátt í viðhaldi brjóstakrabbameinsfrumna hjá mönnum. Rannsóknir hafa sýnt að CRISPR/Cas9-miðlað útsláttarferli Crypto-1 bælir krabbameinsvöxt og meinvarp. Því gæti Crypto-1 orðið mikilvægt meðferðarmarkmið fyrir TNBC (Castro o.fl., 2015).
XCL12 próteinið og chemokine viðtakinn CXC (CXCR4 og CXCR7) gegna ýmsum hlutverkum í frumufjölgun, vexti, flutningi og innrás krabbameinsfrumna (Wu o.fl., 2015). Þessir chemokine viðtakar hafa verið tengdir við þróun TNBC í gegnum margar boðleiðir bæði í in vivo og in vitro líkönum (Wu o.fl., 2015). Að auki er virkjun CXCR4 og CXCR7 tengd meiri næmi fyrir meinvörpum og slæmri horfur í TNBC (Karn o.fl., 2022). Þess vegna gæti rothögg á CXCR4 og CXCR7 orðið áhrifarík lyfjamarkmiðgen við meðferð brjóstakrabbameins, þar á meðal TNBC. Rannsókn eftir Yang o.fl. Yang o.fl. (2019) notuðu CRISPR/Cas9 til að rothögga CXCR4 og CXCR7 genin saman og komust að því að fjölgun, vöxtur, flutningur og innrás TNBC voru verulega hamluð (Yang o.fl., 2019).
Aukið magn miR-3662, krabbameinsgensins TNBC, sást í brjóstakrabbameinsvefjum (Yi o.fl., 2022). Sýnt hefur verið fram á að niðurbrot miR-3662 hamlar vexti og meinvarpi brjóstakrabbameinsæxla bæði in vivo og in vitro (Agarwal og Gupta, 2021). HBP-1 er öflugur hemill á Wnt/-catenin boðleiðinni og er líklega ábyrgur fyrir miR-3662-miðlaðri vexti TNBC frumna. Nýlega komust Yi o.fl. að því að miR-3662-HBP1 ásinn stjórnar Wnt/-catenin boðleiðinni í TNBC frumum (Yi o.fl., 2022). Vegna æxlissértækrar tjáningar sinnar gæti miR-3662 verið mögulegt meðferðarmarkmið fyrir TNBC. Því gæti niðurbrot miR-3662 með CRISPR/Cas9 verið frábær aðferð til að þróa ný lyf til meðferðar á TNBC.
UBR5 er 300 kDa núkleófosfóprótein sem hefur verið skilgreint sem lykilstjórnandi æxlismyndunar, meinvarpa og ónæmissvörunar í ýmsum krabbameinum (Shearer o.fl., 2015; Fu o.fl., 2023). Greint hefur verið frá því að UBR5 sé mjög uppstýrt í TNBC sýnum og örvi ERα virkni með því að örva fjölgun með úbíkvítín lígasa virkni sinni (Bolt o.fl., 2015). Rannsóknir á heilum exome raðgreiningu á frum-TNBC sýnum sýndu einnig aukna tjáningu UBR5, sem bendir til hlutverks þess í þróun TNBC. Að auki sýndi CRISPR/Cas9-knúin eyðing á UBR5 marktæka hömlun á TNBC meinvarpi og vexti í tilraunamúsalíkönum. Ennfremur endurheimti þátttaka UBR5 í villtum músamódeli fulla virkni þess, en þessi áhrif sáust ekki í óvirkjum stökkbreyttum stofnum (Liao o.fl., 2017). Skortur á UBR5 tengist aukinni frumudauða (apoptosis), drepi og hömlun á æxlisvexti í millifrumukrabbameini (TNBC) vegna lélegrar æðamyndunar. Vegna taps á UBR5 minnkar útbreiðsla æxla til fjarlægra líffæra og UBR5 veldur óeðlilegri EMT aðallega með því að draga úr E-cadherin tjáningu (Zhang og Weinberg, 2018). Nýlega hefur verið sýnt fram á að UBR5 er mjög mikilvægur þáttur í IFN-γ-örvuðum PDL1 umritun í TNBC vegna skorts á E3 ubikvitínunarvirkni. RNA umritunargreining leiddi í ljós að UBR5 gæti haft kerfisbundin áhrif á gen sem tengjast IFN-γ ferlinum og stuðlað að PDL1 umbreytingu með því að auka virkjunarstig próteinkínasa RNA (PKR) og merkjaleiðara og virkjara þess, umritun 1 (STAT1) og interferon stjórnunarþáttar 1 (IRF1). Hins vegar hefur CRISPR/Cas9-miðlað samsett afnám UBR5 og PD-L1 tjáningar samverkandi meðferðaráhrif en hvort tveggja í sér hindrunin, með djúpstæð áhrif á æxlisörumhverfið (Wu o.fl., 2022). Þannig gæti CRISPR/Cas9 verið mikilvægt tæki til að hamla virkni UBR5 og þar með bæla niður meinvörp í TNBC og æxlisvöxt.
ROR1 er himnuprótein af gerð I sem kemur fram við krabbamein og fósturþroska og hefur verið skilgreint sem krabbameinsfrumnaprótein (Nicholas Borcherding, 2014). Innrásarhegðun ýmissa krabbameina hjá mönnum tengist uppstjórnun ROR1. Efnilegar niðurstöður hafa fengist úr in vivo og in vitro rannsóknum á meðferðarefnum sem miða á ROR1 (Chien o.fl., 2016). Hækkað magn ROR1 mRNA í brjóstavefssýnum hefur einnig verið tengt árásargjörnum grunnfrumulíkum brjóstakrabbameinum (BL) og flutningi þeirra til annarra líkamshluta. Ennfremur hefur ofurtjáning ROR1 verið skilgreind sem horfur á þróun TNBC (Chien o.fl., 2016). Hins vegar væri þöggun á ROR1 með CRISPR/Cas9 til að bæla vöxt og meinvarp TNBC áhrifarík stefna.
Síalýleringarferlið felur í sér að bæta síalsýru við glýkókonjugöt, sem er hvött af síalýltransferösum (ST). ST8SIA1 tilheyrir ST fjölskyldunni og gegnir mikilvægu hlutverki í meingerð ýmissa sjúkdóma eins og eitilfrumuhvítblæðis og krabbameins í ristli og endaþarmi (Chang o.fl., 2018). RNA raðgreining sýnir að ST8SIA1 er mikið tjáð í brjóstvef sjúklinga með TNBC og er jákvætt tengd stökkbreytingum í æxlisbælandi geninu p53, sem gæti stuðlað að meingerð TNBC (Battula o.fl., 2017). Að auki tekur ST8SIA1 þátt í meinvarpi og endurkomu TNBC, sem bendir til þess að það gegni mikilvægu hlutverki í tilurð og þróun TNBC. Í in vitro líkani af TNBC sýndi CRIPSR/Cas9 fram á að niðurfelling ST8SIA1 hindrar vöxt og meinvarp (Battula o.fl., 2017). Þetta bendir til þess að CRISPR/Cas9 gæti verið mikilvægt tæki til að hindra virkni ST8SIA1 krabbameinsgensins við meðferð á TNBC.
NAT1 er efnaskiptaensím sem hvatar myndun II. stigs útlægra efnasambanda og er tjáð í nánast öllum vefjum manna. NAT1 getur notað meðvirka fólatið til að miða á asetýl-CoA (asetýl-CoA) jafnvel án arómatísks amín hvarfefnis (Stepp o.fl., 2015; Laurieri o.fl., 2014). Rannsóknir hafa sýnt að NAT1 stjórnar virkni matrix metalloproteinasa 9 (MMP9) í brjóstakrabbameinsfrumumódelum og verndar gegn hvarfgjörnum súrefnistegundum (ROS) við glúkósaskort (Wang o.fl., 2018). Sýnt hefur verið fram á að eyðing NAT1 hamlar pýrúvat dehýdrógenasa fléttunni, sem leiðir til truflunar á starfsemi hvatbera (Wang L. o.fl., 2019). Að auki hafa ýmsar aðrar skýrslur sýnt að NAT1 hömlun með því að nota litlar sameindir og siRNA þöggun getur dregið úr innrásargetu og fjölgun brjóstakrabbameinsfrumna (Stepp o.fl., 2018). Nýlega var CRISPR/Cas9 notað til að bæla NAT1 í brjóstakrabbameinsfrumulínunni MDA-MB-231, sem hefur áhrif á frumuefnaskipti eftir tjáningarstigi hennar. Þessi rannsókn sýndi einnig að NAT-1 er mikilvægt fyrir framgang og meinvarp TNBC (Carlisle o.fl., 2020).
Samræmd umritun krabbameinsgena er stjórnað af ofurörvum, umritunarþáttum og meðvirkum þáttum (Hnisz o.fl., 2015). Að auki eru hópur sýklínháðra kínasa (CDK), svo sem CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 og CDK13, nauðsynlegir fyrir stjórnun umritunar. Meðal þeirra tekur CDK7 þátt í fosfórun RNA pólýmerasa II, sem er mjög mikilvægt fyrir upphaf og útbreiðslu umritunar krabbameinsgena í meingerð TNBC. Í byltingarkenndri rannsókn hamlaði eyðing CDK7 með CRISPR/Cas9 TNBC, sem bendir til þess að meingerð TNBC sé CDK7-háð (Wang Y. o.fl., 2015).
Rannsóknir hafa sýnt að stökkbreytingar í MYC og RBP (RNA-bindandi prótein) geta leitt til frumudauða, en stökkbreytingar í einstökum genum í MYC eða RBP hafa ekki áhrif á vöxt krabbameinsfrumna (Einstein o.fl., 2021). Meira en 1000 RBP í erfðamengi mannsins hafa verið skimaðar með því að nota CRISPR/Cas9-byggða bókasafn. Meðal þeirra reyndust 57 RBP vera mikilvægar fyrir vöxt krabbameinsfrumna með mjög hækkað MYC-gildi (Wheeler o.fl., 2020). Að auki er YTHDF2 mikilvægt fyrir að viðhalda vexti TNBC frumna og dregur úr magni metýleraðra umrita við hástigs umritun og þýðingu í krabbameinsfrumum með hærri MYC-tjáningu. Að auki er YTHDF2 ekki nauðsynlegt fyrir krabbameinsfrumur, sem eru minna háðar hækkuðum MYC-gildum til að lengja lifun TNBC sjúklinga (Einstein o.fl., 2021), sem bendir til þess að það gæti verið mögulegt meðferðarmarkmið fyrir lyf sem geta sigrast á TNBC.
Sinkfingurprótein (ZNF) eru um það bil 1% af heildarerfðamengi mannsins. Rannsóknir hafa sýnt að ZNF getur stjórnað frumufjölgun í ýmsum krabbameinum, svo sem lifrarkrabbameini, brjóstakrabbameini og ristilkrabbameini (Zhang W. o.fl., 2021; Li o.fl., 2017). Bókasöfn sem mynduð eru með CRISPR-knockout hafa verið notuð til að skima fyrir ýmsum æxlisbælandi genum (TSG) í brjóstakrabbameinsfrumum (Shalem o.fl., 2014). Síðan þá hefur umritunarrannsókn á CRISPR/Cas9 ZNF319-eyðilögðum brjóstakrabbameinsfrumum sýnt að ZNF319 er æxlisbælandi gen sem dregur úr frumufjölgun brjóstakrabbameins og tekur því þátt í ýmsum hugsanlegum merkjasendingakerfum og öðrum líffræðilegum störfum (Wang L. o.fl., 2022).
Ferroptósa er tegund forritaðs frumudauða sem er háð nærveru járns. Það er vitað að þróun ferroptósu er undir áhrifum nærveru lípíðperoxíða. Þar að auki hefur verið greint frá því að PKCβII sýni snemmbúna lípíðperoxun og aukin lípíðperoxun tengist ferroptósu. Skimun á bókasafni CRISPR/Cas9-miðlaðra kínasahemla leiddi í ljós að PKCβII tekur þátt í ferli lípíðperoxunar, sem er mikilvægt fyrir ferroptósu í MDA-MB-231 frumum (Zhang o.fl., 2022). Þetta bendir því til þess að rothögg á PKCβII með CRISPR/Cas9 gæti verið mögulegt markmið æxlisbælandi gena til meðferðar á sjúkdómum sem tengjast ferroptósu (Zhang o.fl., 2022).
Talið er að lyfjaónæmi beri ábyrgð á um það bil 90% dauðsfalla krabbameinssjúklinga og sé ein helsta áskorunin í krabbameinsmeðferð (Bukowski o.fl., 2020). Niðurstöðurnar benda til þess að nægilegur fjöldi gena sem tengjast lyfjaútflæði, DNA viðgerð, frumudauða og ýmsum frumuboðleiðum tengist lyfjaónæmi (Haider o.fl., 2020). Meðal þeirra hafa nokkur gen verið skotmörk CRISPR/Cas9 tækja og hafa sýnt efnilegan árangur í að draga úr lyfjaónæmi og auka virkni krabbameinsmeðferða (Vaghari-Tabari o.fl., 2022). Að auki hefur verið bent á að skimunarbókasöfn fyrir CRISPR/Cas9 gena með mikilli afköstum geti breytt virkni hugsanlegra markmiða lyfjaónæmisgena (Shalem o.fl., 2015). Til að bera kennsl á gen fyrir paklítaxelónæmi var RNA raðgreining ásamt erfðamengisvíðri sgRNA bókasafnsskimun notuð til að bera kennsl á átta mögulega gen, þar á meðal histón deasetýlasa 9 (HDAC9), sem tengjast lyfjaónæmi hjá sjúklingum með endurtekið TNBC (B o.fl., 2020). Í annarri rannsókn sást aukin tjáning á díseríni/þreóníni og týrósín prótein kínasa (DSTYK) meðan á lifun TNBC sjúklinga stóð sem fengu krabbameinslyf. Ennfremur jók CRISPR/Cas9-miðlað niðurbrot DSTYK verulega frumudauða lyfjaónæmra krabbameinsfrumna in vitro (SUM102PT frumur og MDA-MB-468 frumur) og in vivo TNBC líkan (Ogbu o.fl., 2021).
Þó að TNBC hafi óeðlilega virkjun á MAPK ferlinu, eru klínísk áhrif MEK-miðaðra meðferða léleg. Skimun á CRISPR/Cas9 erfðamengisbókasafni leiddi í ljós að hömlun á PSMG2 (próteóm samsetningarfylgis 2) gerir TNBC BT549 og MB468 frumur næmari fyrir MEK hemlinum AZD6244. Niðurbrot PSMG2 með CRISPR/Cas9 breytti eðlilegri próteasómvirkni, sem leiddi til sjálfsáts-miðlaðrar sundrunar PDPK1, og þar með bætti krabbameinsfrumur enn frekar í TNBC músamódelum sem voru örvuð af AZD6244 (MEK hemli) og MG132 (próteasóm hemli). Þannig er hægt að gefa próteasóm og MAP kínasa (MEK) hemla saman til að draga úr frumufjölgun æxlisfrumna (Wang X. o.fl., 2022).
CRISPR/Cas9 hefur einnig verið notað til að skima fyrir tapi á genastarfsemi sem leiðir til ónæmis gegn TNBC (Shu o.fl., 2020). Ge o.fl. útskýrðu verkunarháttur lyfjaónæmis krabbameinsfrumna sem meðhöndlaðar eru með JQ1, BET brómódómahemli (BBDI), í TNBC. Með því að nota CRISPR/Cas9 komust þeir að því að eyðing rb1 gensins olli því að TNBC urðu ónæm fyrir krabbameinslyfinu JQ1. Þess vegna er rb1 virkni mikilvæg í svörun við JQ1 lyfjum í TNBC. Þeir greindu einnig frá því að paklítaxel er CDK4/6 kínasa/örpíplahemill og að samsetning þess við BBDI eins og JQ1 gæti veitt efnilega meðferðarsvörun við lyfjaónæmum TNBC (Ge o.fl., 2020).
Greint hefur verið frá því að umritunarlandslag langs ókóðandi RNA (lncRNA) beri ábyrgð á ónæmi gegn formeðferð í TNBC. Þessi rannsókn sýnir að fimm mismunandi MALAT1 lncRNA umrit eru mjög tjáð í TNBC. Að auki jók CRISPR/Cas9-miðlað eyðing á MALAT1 næmi TNBC BT-549 frumna fyrir paklítaxel og doxorubicíni, sem bendir til hugsanlegs hlutverks MALAT1 ónæmis í TNBC (Shaath o.fl., 2021).
Stökkbreytingar í BRCA1 (BRCA1m) eru ólíkar og því erfiðar að greina. Að beina sjónum sínum að PARP1 (fjöl(ADP-ríbósa) pólýmerasa), sem er tilbúið banvænt félagi BRCA1, gæti aukið næmi lyfja í TNBC. Með því að nota CRISPR/Cas9 jók eyðing PARP1 næmi krabbameinslyfja eins og doxorubicins, gemcitabine og docetaxel fyrir mBRCA1 stökkbreyttum TNBC frumum, sem bendir til þess að PARP1 taki einnig þátt í lyfjaónæmi í TNBC (Vaghari-Tabari o.fl., 2022). Stökkbreytingar í æxlisbælandi genunum BRCA1 eða BRCA2 eru þekktar fyrir að auka líkur á að fá brjóstakrabbamein hjá fólki. Meðferð þessara sjúklinga krefst notkunar PARP-hemla. Að auki hefur verið sýnt fram á að útrýming núkleótíðabjörgunarþáttarins DNPH1 með CRISPR/Cas9 getur fjarlægt eitrað núkleótíðið 5-hýdroxýmetýldeoxýúridín (hmdU) mónófosfat og þannig aukið svörun BRCA-skortsfrumna við næmi fyrir PARP-hemlum (Fugger o.fl., 2021). Þannig gætu CRISPR/Cas9 og PARP1-hemlar orðið mikilvæg meðferðaráætlun við TNBC.
Genið fyrir gegndreypandi glýkóprótein (P-gp) er fjölónæmisgen sem er almennt uppstýrt í um það bil 41% allra transnána krabbameina (TNBC) (Sun o.fl., 2020). P-gp-örvaður lyfjaútflæði hefur verið skilgreindur sem lykilstjórnandi lyfjaónæmis í brjóstakrabbameini. P-gp hemlar hafa sýnt aukna næmi fyrir krabbameinslyfjum í brjóstakrabbameini (Famta o.fl., 2021). Því gæti CRISPR/Cas9-miðlað eyðing eða bæling á P-gp og P-gp hemlum verið mjög mikilvægar aðferðir til að sigrast á lyfjaónæmi í TNBC.
ATP-bindandi flutningspróteinið G2 (ABCG2) er vitað að valda lyfjaónæmi í TNBC (Palasuberniam o.fl., 2015), þó að engar skýrslur séu til um tengslin milli CRISPR/Cas9 og þöggunar ABCG2 og óvirkjunar æxlisbælandi gena. PTEN getur aukið virkjun ABCG2 (Palasuberniam o.fl., 2015), (Deepak Singh o.fl., 2021). Því gæti notkun CRISP/Ca9 til að fjarlægja ABCG2 og samsetning þess við ABCG2 hemil verið viðeigandi meðferð til að sigrast á lyfjaónæmi í TNBC. Tafla 2 nefnir CRISPR/Cas9 sem beinist að öllum ónæmisgenum.
Tafla 2. CRISPR/Cas9 beinist að ýmsum TNBC ónæmisgenum til að gera frumur næmari fyrir krabbameinslyfjum.
CRISPR/Cas9 bókasöfn eru hugsanleg verkfæri til að skima fyrir stökkbreytingum í genum sem tengjast krabbameinsmeingerð (Chan o.fl., 2022). Þessi skimunaraðferð felur í sér fjögur skref eins og (a) smíði bókasafns, (b) lentiveiru umbreytingu, (c) svipgerðarskimun og (d) greiningu á markgenum. Þó að TNBC hafi óeðlilega virkjun á MAPK ferlinu, eru klínískar horfur af MEK-markvissri meðferð fyrir TNBC sjúklinga sem bera stökkbreytingar í æxlisbælandi genum eins og PTEN, RB1 og TP53 mjög slæmar.
Að auki var genaútsláttarskimun með CRISPR/Cas9 prófað á öflugasta og sértækasta sameindina, dehydrocatrol, sem er að finna í miklu magni í blóma- og laufútdrætti frá Gvatemala, til að skilja áhrif dehydrocatrol á MDA-MB-231. Ferli sértækrar frumudrepandi áhrifa. Einkenni mesenchymal stofnfrumugerða í TNBC undirgerðum. Þessi CRISPR/Cas9-byggða skimun leiddi einnig í ljós að HSD17B11, gen sem kóðar fyrir 17β-hýdroxýsteróíð dehýdrógenasa af gerð 11, er mikið tjáð í MDA-MB-231 frumum og leiðir til dehýdrófalkarínóls sem er sértækt fyrir MDA-MB-231 frumur (Grant o.fl., 2020). Þetta bendir því til þess að CRISPR/Cas9 erfðaskimun hafi mikla möguleika á að bera kennsl á ferla sem liggja að baki krabbameinshemjandi eiginleikum hugsanlegra náttúrulegra efnasambanda.
Að auki var varnarleysi TNBC fyrir krabbameini rannsakað með óhlutdrægri erfðamengisvíðri in vivo CRISPR/Cas9 skimun, sem sýndi fram á tengsl milli krabbameinsvaldandi og æxlisbælandi ferla. Greint hefur verið frá því að lykilþættir mTOR og Hippo ferlanna gegni mikilvægu hlutverki í stjórnun æxla í TNBC. Að auki hafa rannsóknir sýnt að lyfjafræðileg hömlun á mTORC1/2 og YAP krabbameinspróteini hamlar á áhrifaríkan hátt sjúkdómsvaldandi eiginleika TNBC með því að nota in vitro lyfja-matrix samverkunarlíkan og in vivo sjúklingaafleiddar xenografts. Ennfremur eykur Torin-1-miðlað mTORC1/2 hömlun makrópínófrumufjölgun, en verteporfín-framkölluð YAP hömlun leiðir til frumudauða TNBC. Samanlagt undirstrika þessar niðurstöður kraft og styrk erfðamengisvíðrar in vivo CRISPR skimunar til að bera kennsl á nýjar og árangursríkar meðferðir við TNBC (Dai o.fl., 2021).
Truflun á ónæmiskerfinu er mikilvægur þáttur í æxlismyndun. Krabbameinsfrumur komast hjá úthreinsun ónæmiskerfisins með því að komast framhjá varnarkerfum, þar á meðal með því að trufla virkni ónæmisfrumna í æxlisörumhverfinu og skerða ónæmiskerfið. Því gæti þróun bætts ónæmiskerfis verið lykilatriði í baráttunni gegn æxlum. Notkun genabreytinga sem byggja á CRISPR/Cas9 fjallar um nokkur mál sem tengjast ónæmisbresti frá mismunandi sjónarhornum. CRISPR/Cas9 hefur verið notað til að bæta æxlisónæmi gegn brjóstakrabbameini í gegnum eftirfarandi leiðir (Mynd 3).
Mynd 3. CRISPR/Cas9 ónæmismeðferð beinist að TNBC frumum. Tap á CDK5 og niðurfelling PDL1 og CD155 styrkir ónæmiskerfið. Á sama hátt jók tap á A2AR og niðurfelling á TAA eins og HER2, mucin 1 og TEM8 skilvirkni CAR-T frumna við að drepa krabbameinsfrumur. Skimun á CRISPR/Cas9 T frumum hefur sýnt að röskun á p38 kínasa eykur æxlishemjandi virkni T frumna. T frumur sem eru breyttar með CRISPR/Cas9 auka tjáningu TCR (T frumuviðtaka), sem leiðir til þess að T frumur hafa æxlishemjandi virkni.
Markmið ónæmismeðferðar er að örva ónæmiskerfið til að ráðast á krabbameinsfrumur. Ofurtjáning ónæmiseftirlitspróteina kemur venjulega í veg fyrir sjálfsofnæmisviðbrögð en getur hjálpað krabbameinum að forðast þau (Topalian o.fl., 2015). Þessi prótein koma í veg fyrir ónæmisviðbrögð með því að bindast viðtökum á yfirborði ónæmisfrumna. Fjölmörg eftirlitsprótein (eins og CD155 og PD-L1) miða á PD-1 viðtakann á ónæmisfrumum og eru tjáð í brjóstakrabbameini, sérstaklega TNBC (Li Y.-C. o.fl., 2020). Niðurfelling PD-L1 eða viðtaka þess með CRISPR/Cas9 getur örvað ónæmiskerfið til að ráðast á TNBC æxli (Yahata o.fl., 2019). Að auki hefur verið sýnt fram á að niðurfelling PD-L1 tjáningar í gegnum CRISPR/Cas9-miðlaða eyðingu CDK5 hamlar æxlisvexti in vitro og in vivo (Deng o.fl., 2020). Vaxtarhömlun í in vitro og in vivo líkönum af brjóstakrabbameini bendir til þess að shRNA-miðlað minnkun á CD155 geti haft meðferðaráhrif á brjóstakrabbamein (Gao o.fl., 2018).
CAR T frumur tjá CAR sem þekkja æxlistengd mótefnavaka (TAA) og geta notað niðurbrot á eftirlitspróteinum til að auka virkni sína (Li C. o.fl., 2020). Ýmis möguleg skotmörk eru fyrir CAR T frumumeðferð við brjóstakrabbameini, þar á meðal nokkur TAA eins og HER2, mucin1 og TEM8 (Bajgain o.fl., 2018). Vísbendingar eru um að CAR T frumur sem miða á mesótelín (ofurtjáð í TNBC BT-459 frumum) séu áhrifaríkari gegn krabbameini þegar PD-1 er slegið út með CRISPR/Cas9 (Hu o.fl., 2019). Hins vegar er einangrun T frumna frá sjúklingum og síðan breyting á þeim ex vivo vinnuaflsfrekt og tímafrekt ferli. Þó að alhliða T frumur geti dregið úr einangrunarþörfum, ætti að fjarlægja gjafa T frumur sem tjá HLA af flokki I og T frumuviðtaka (TCR) til að koma í veg fyrir frávik í ígræðslu gegn hýsli (Ren o.fl., 2017, 2017a). Með því að nota CRISPR/Cas9 getur HDR samtímis útrýmt TCR og HLA og slegið út genið sem umritar CAR. Rannsóknir hafa sýnt að CRISPR/Cas9 er hægt að nota til að koma anti-CD19 CAR inn í TCR genið og þannig framleiða CAR á skilvirkan hátt án þess að tæma T frumur (Dimitri o.fl., 2022). Fjölþættar tækni hefur verið þróaðar til að búa til ósamgena CAR T frumur með því að útrýma samtímis TCR, beta-2-míkróglóbúlíni (B2M), HLA-I undireiningu og öðrum próteinum eins og PD-1 og CTLA-4, sem geta haft betri krabbameinshemjandi eiginleika gegn TNBC (Eyquem o.fl., 2017; Liu o.fl., 2017; Ren o.fl., 2017b; Dimitri o.fl., 2022).
Notkun CRISPR/Cas9 gæti aukið virkni CAR-T frumna. Adenosín er þekkt fyrir að hafa ónæmisbælandi eiginleika og getur dregið úr krabbameinsónæmi með því að hindra starfsemi T-frumna og virkja adenosín A2A viðtaka (A2AR) (Vigano o.fl., 2019). Þöggun á A2AR með CRISPR/Cas9 jók verulega virkni CAR-T frumna in vivo (Giuffrida o.fl., 2021). T frumur eru þekktar fyrir að sýna ýmis svipgerðareinkenni eins og frumuvöxt, sérhæfingu, oxunarálag og erfðaálag. Skimun á T frumum byggð á CRISPR/Cas9 leiddi í ljós röskun á 25 mismunandi T-frumuviðtaka kínösum. Meðal þeirra hefur verið sýnt fram á að eyðing p38 kínasa eykur æxlishemjandi virkni T-frumna, sem bendir til þess að p38 kínasi sé lykilstjórnandi í stjórnun CAR-T frumna (Gurusamy o.fl., 2020).
Hægt er að erfðabreytta T-frumur með CRISPR/Cas9 til að framleiða mjög tjáðar TCR-frumur. Flutningur erfðabreyttra T-frumna til sjúklinga hefur sýnt sterkari krabbameinshemjandi virkni en innrænar T-frumur. Þess vegna geta innrænar TCR-frumur keppt við erfðabreyttar TCR-frumur í sjúklingum, sem getur haft áhrif á möguleika krabbameinsónæmismeðferðar. Til að vinna bug á þessu vandamáli getur notkun CRISPR/Cas9 til að fjarlægja innrænt TCR-β í viðtakandafrumum og síðan flytja TCR-β T-frumur til krabbameinssjúklinga sýnt betri ónæmissvörun gegn krabbameini án þess að þörf sé á kynferðislegri samkeppni innrænna TCR-frumna (Fan o.fl. 2018). Þannig, fyrir utan CRISPR-breyttar T-frumur, eru TCR-frumur þúsund sinnum næmari fyrir æxlisvaka en venjulegar TCR-erfðabreyttar T-frumur. Að auki, í ýmsum hvítblæði, sýna breyttar T-frumur sem myndast með γδ TCR+ CRISPR meiri tjáningu á CD4+ og CD8+ T-frumum en hefðbundinn TCR-flutningur (Legut o.fl., 2018). Þannig gætu breyttar T-frumur, sem myndaðar eru með CRISPR/Cas9, verið áhrifarík ónæmismeðferð til að sigrast á TNBC.
Integrín eru frumuviðloðunarsameindir sem eru til staðar í frumuhimnum og stuðla að bindingu frumna við utanfrumuefnið (ECM) (Hamidi og Ivaska, 2018). Truflun á integrínum tengist þróun og frumuflutningi krabbameins með því að breyta utanfrumuefninu, sem leiðir til lifunar krabbameinsfrumna í blóðrásinni (Hamidi og Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-miðlað niðurbrot integríns hægir á æxlisframvindu, meinvörpum og nýlenduvæðingu í TNBC. Greint hefur verið frá því að niðurbrot integríns a5 (ITGA5) dragi úr frumuflutningum og framvindu í öðrum krabbameinum eins og lungnakrabbameini (Ju o.fl., 2017), sem bendir til þess að integrín a5 gæti einnig verið lykilþáttur í meingerð TNBC.
Að búa til knockout-mýs með hefðbundnum aðferðum fósturvísisstofnfrumna (ES) er vinnuaflsfrekt, tímafrekt og óhagkvæmt ferli. Það tekur mánuði og ár að miða á ES-frumur með einsleitri endurröðun, rækta kímæra mýs og síðan krossa þær við arfblendnar mýs til að framleiða arfhreina afkvæmi. Flókin krossræktun er nauðsynleg til að búa til mýs með margar erfðabreytingar. Hins vegar hafa mörg vandamál komið upp þegar notaðar eru mýs sem eru búnar til með fjarlægingu ES-frumna með CRISPR/Cas9 eða með örsprautun CRISPR/Cas9 íhluta í frjóvguð egg einsfrumu. Til dæmis á sér oft stað breytingar á tvíallelískum stöðum og eru ekki genasértækar. Nýlega var greint frá því að ES-frumur sem nota CRISPR/Cas9 tækni geta samtímis sett inn tvíallelískar stökkbreytingar í allt að 5 gena (Nishizono o.fl., 2021). Í þessu skyni voru Cas9 mRNA og fimm genasértæk gRNA samtímis erfðabreyttar í ES-frumur. Þetta undirstrikar loforð og árangur þessarar aðferðar, þó að þessar stökkbreytingar gætu hafa verið erfðar þegar stofnlínur voru ræktaðar til að framleiða fimmföldu rothöggmýs. Rannsóknin greinir einnig frá óvæntri uppgötvun: ES frumur eru ekki lengur nauðsynlegar til að búa til erfðabreyttar mýs. Í staðinn, til að fjarlægja ákveðnar genaafurðir, voru Cas9 mRNA og gRNA sprautað í fósturvísa á einfrumustigi. Fyrir vikið hafa verið búnar til rothöggmýs sem fræðilega má nota til að rannsaka afleiðingar genaeyðingar í músum (Qin o.fl., 2016). Þannig gerir CRISPR/Cas9 kleift að búa til erfðabreyttar mýs til að meðhöndla TNBC á lægri kostnaði en hefðbundin erfðatækni. Með því að nota CRISPR/Cas kerfið hefur verið þróað nýtt rothöggmýslíkan sem getur með góðum árangri kynnt punktbreytingar í einu eða fleiri innrænum genum í TNBC. Byggt á þessari hugmynd er einnig hægt að þróa dýralíkön af TNBC með því að nota CRISPR/Cas9-miðlaða eyðingu á BRCA1 og p53, sem leiðir til taps á HR viðgerð, erfðafræðilegs óstöðugleika og stökkbreyttra svipgerða (Annunziato o.fl., 2020).
Eins og er eru ýmsar aðferðir eins og brjóstamyndataka, segulómun (MRI) og ómskoðun notaðar til að greina TNBC. Þessar aðferðir hafa þó nokkrar takmarkanir. Brjóstamyndataka er notuð til að greina staðbundinn brjóstvef frekar en meinvörp, þar sem krabbameinsfrumur hafa flust til annarra líffæra. Ómskoðun er ekki áreiðanleg aðferð til að greina TNBC (Chen og Lee-Felker, 2023). Segulómun hefur meiri næmni en ómskoðun og brjóstamyndataka, en greiningarnákvæmni hennar er takmörkuð (Sha og Chen, 2022). Vefjasýnataka er ífarandi leið til að bera kennsl á krabbameinsfrumur. Hins vegar getur vefjasýnataka í sumum tilfellum misst af krabbameinsvef ef nálin fer frá svæðinu sem verið er að skoða. Að auki er hún mjög dýr og getur verið áfallafull fyrir sjúklinginn. TNBC er ólík tegund krabbameins, þannig að vefjasýnataka gæti ekki gefið nægar upplýsingar um tegund krabbameins. Þess vegna er brýn þörf á nýrri greiningarlega áreiðanlegri aðferð til að greina TNBC. CRISPR/Cas9 gæti þjónað sem mjög næmur og lágmarksífarandi valkostur við greiningu brjóstakrabbameins. Í þessu skyni er hægt að nota CRISPR/Cas9-byggðar aðferðir til að bæta PCR-aðferðir við greiningu á TNBC. Í fyrsta lagi eru Cas9 og cpf1 próteinin úr CRISPR kerfinu notuð til að fjarlægja ósértækt DNA, og síðan geta þessi tvö prótein (Cas9 og cpf1) þekkt PAM-röðina áður en þau bindast mark-DNA (Deepak Singh o.fl., 2021). Þannig getur PCR greint stökkbreytingar sem tengjast krabbameinsþróun. Nokkrar rannsóknir hafa tekið upp þessa CRISPR-byggðu aðferð til að greina mismunandi stökkbreytingar í mismunandi krabbameinum (Safari o.fl., 2019). Þannig geta CRISPR-byggðar PCR-aðferðir dregið úr því hversu háð greining á TNBC er ífarandi aðferðum eins og vefjasýnabundinni ónæmisvefjaefnafræði.
Einnig hefur verið sýnt fram á erfðafræðilegar breytingar á stjórnun hormónaviðtaka í sjúklingum með TNBC (Chen og Russo, 2009). CRISPR/Cas9-byggðar PCR-aðferðir sem nota örflögur til greiningar á staðnum geta fylgst með þessum stökkbreytingum á áhrifaríkan hátt (Hajian o.fl., 2019). Það gæti einnig veitt heilbrigðisstarfsmönnum viðeigandi upplýsingar um tilteknar stökkbreytingar í sjúklingum með TNBC, sem gæti hjálpað til við að bæta meðferðarferli þeirra. Þessi samsetta tækni hefur þó takmarkanir. Því er þörf á umfangsmiklum rannsóknum áður en hægt er að nota þessa CRISPR/Cas-PCR aðferð í heilbrigðisþjónustu til greiningar á TNBC (Yang o.fl., 2019).
Birtingartími: 14. október 2024